Βιοχημική και ανοσολογική μελέτη της δράσης των αυξητικών παραγόντων στη σύνθεση μεμβρανικών και εκκρινόμενων πρωτεογλυκανών σε κυτταρικές σειρές ινοσαρκώματος και φυσιολογικών ινοβλαστών

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share



PhD thesis (EN)

2008 (EN)
Βιοχημική και ανοσολογική μελέτη της δράσης των αυξητικών παραγόντων στη σύνθεση μεμβρανικών και εκκρινόμενων πρωτεογλυκανών σε κυτταρικές σειρές ινοσαρκώματος και φυσιολογικών ινοβλαστών

Φθενού, Ελένη

Πλαίτάκης, Ανδρέας
Σπαντίδος, Δημήτρης
Τζανακάκης, Γιώργος
Καραμάνος, Νίκος
Τσατσάκης, Αριστείδης
Σουρβίνος, Γιώργος

Το ινοσάρκωμα ορίζεται ως κακοήθης όγκος των μαλακών μορίων , αποτελούμενος από ινοβλάστες. Είναι ασυνήθης όγκος καθώς αριθμεί λιγότερο του 1% στους ενήλικες και του 7% όλων των παιδιατρικών κακοηθειών. Δεν υπάρχουν ανοσολογικοί δείκτες για αυτόν τον τύπο κυττάρων, με αποτέλεσμα η διάγνωση του ινοσαρκώματος με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους να γίνεται εξ αποκλεισμού από τους άλλους τύπους σαρκωμάτων. Οι πρωτεογλυκάνες είναι θειομένες πρωτεΐνες αποτελούμενες από έναν πρωτεινικό κορμό συνδεδεμένο με γλυκοζαμινογλυκάνες. Συμμετέχουν στη ρύθμιση σημαντικών κυτταρικών γεγονότων όπως, κυτταρική προσκόλληση, διήθηση, διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμό. Συμμετέχουν επίσης στην οργάνωση του εξωκυττάριου χώρου μέσω των αλληλεπιδράσεων τους με σημαντικά μακρομόρια όπως, το κολλαγόνο, τις λιποπρωτεϊνες και τους αυξητικούς παράγοντες. Λίγα είναι γνωστά για τις PGs και GAGs στους όγκους των μαλακών μορίων. Όγκοι του στρώματος και όγκοι ινώδους ιστού περιέχουν PGs και GAGs σε υψηλότερα επίπεδα από ότι ο περιβάλλον ιστός. Η ανάπτυξη του καρκίνου ως εξέλιξη με πολλά βήματα χρειάζεται μεταξύ των άλλων και επιπλέον μελέτες για των χαρακτηρισμό της ανάμειξης των διαφόρων πρωτεογλυκανών σε κάθε βήμα των νεοπλασιών. Καθορισμός του ρόλου της κάθε πρωτεογλυκάνης και ξεχωριστά των εκκρινόμενων ή/και των συνδεδεμένων με την κυτταρική μεμβράνη πρωτεογλυκανών στους παθολογικούς μηχανισμούς. Η πληρέστερη ανάλυση της δομής των γλυκοζαμινογλυκανικών αλυσίδων πρέπει επίσης να συσχετίζεται με την παθολογική ανατομική. Πιστεύεται, ότι η γνώση της δομής και του ρόλου ειδικών πρωτεογλυκανών θα προσφέρει μηχανισμούς δράσης που θα βοηθήσουν την θεραπεία του καρκίνου. Για την μελέτη της έκφρασης των πρωτεογλυκάνων σε κύτταρα ινοσαρκώματος χρησιμοποιήσαμε ως βιολογικά μοντέλα δυο κυτταρικές σειρές ινοσαρκώματος από άνθρωπο την HT1080 και την B6FS. Τα κύτταρα ΗΤ1080 χαρακτηρίζονται ως επιθηλιακά, ενώ τα B6FS κύτταρα ως ινοβλαστοειδή, καθώς επίσης και φυσιολογικούς ινοβλάστες (DLF) απο πνεύμονα ανθρώπου. Ξεκινήσαμε με τον χαρακτηρισμό των πρωτεογλυκανών και των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων που εκφράζει η κάθε μια από τις κυτταρικές σειρές. Στη συνέχεια, μελετήσαμε την επίδραση των αυξητικών παραγόντων, και συγκεκριμένα των PDGF-BB, FGF, και TGF, στα επίπεδα των έκφρασης των πρωτεογλυκανών. Η περιοχή γύρω από το κύτταρο αποτελείται κυρίως από τη πρωτεογλυκάνη βερσικάνη και το υαλουρονικό οξύ που σχηματίζουν ένα σύμπλοκο. Σε πολλούς νεοπλαστικούς ιστούς η αλλαγή της έκφρασης της βερσικάνης και του υαλουρονικού οξέους σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου. Στον καρκίνο του μαστού και του προστάτη η αυξημένη έκφραση βερσικάνης στα στρωματικά κύτταρα και σε αυτά γύρω από τον όγκο χρησιμοποιείται σαν καρκινικός δείκτης. Συμπληρωματικά, αυξημένη έκφραση του υαλουρονικού οξέος σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου , του πνεύμονα και του μαστού. Στόχοι της μελέτης ήταν 1) ο χαρακτηρισμός των επιπέδων έκφρασης της βερσικάνης και του υαλουρονικού οξέος στα κύτταρα ινοσαρκώματοςκαι 2) η επίδραση των PDGF-BB, FGF, και TGF αυξητικών παραγόντων στη βιοσύνθεση των παραπανω. Οι κυτταρικές σειρές ινοσαρκώματος που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι HT1080 και B6FS. Επίσης,ινοβλάστες από τον πνεύμονα ανθρώπου (DLF) χρησιμοποιήθηκαν ώστε να συγκριθούν με τα καρκινικά κύτταρα. Η κύρια ισομορφή βερσικάνης που εκφράζουν τα DLF και τα B6FS είναι η βερσικάνη 0 (V0) και η βερσικάνη 1(V1). Χορήγηση TGFΒ2 στα B6FS κύτταρα έδειξε μια στατιστικά συμαντική αύξηση στα επίπεδα των mRNA μεταγράφων των ισομορφών V0 και V1, όπως αναλύθηκε με τη μέθοδο real time PCR. Τα ΗΤ1080 κύτταρα εκφράζουν χαμηλά επίπεδα της V1, η έκφραση της οποίας δεν επηρεάστηκε από κανέναν από τους τρείς αυξητικούς παράγοντες. Ανιχνεύσιμη ποσότητα πρωτείνης βερσικάνης βρέθηκε μόνο στους φυσιολογικούς ινοβλάστες με τη μέθοδο western blotting. Επίσης, χορήγηση TGFΒ2 στους φυσιολογικούς ινοβλάστες είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της βερσικάνης στα DLF κύτταρα. Μέτρηση του ολικού υαλουρονικού οξέος, με τη μέθοδο ELISA, έδειξε τον διπλασιασμό και την εννιά φορές αύξηση του υαλουρονικού οξέος στους φυσιολογικούς ινοβλάστες συγκρίνοντάς την με τα B6FS και ΗΤ1080 κύτταρα ινοσαρκώματος, αντίστοιχα. Στα ΗΤ1080 η βιοσύνθεση του υαλουρονικού οξέος αυξήθηκε με την χορήγηση bFGF , ενώ στα B6FS βιοσύνθεση του υαλουρονικού οξέος αυξήθηκε με την χορήγηση των TGFΒ2 και PDGF-BB. Στη συνέχεια εξετάσαμε την έκφραση σε επίπεδο μεταγράφων των HAS 1, 2 και 3 με τη μέθοδο Real Time PCR. Τα HT1080 εκφράζουν και τις τρεις ισομορφές των HAS. Ο bFGF δείχνει να επηρεάζει τα επίπεδα των HAS αλλάζοντας την ισοροπία μεταξύ τους. Τα Β6FS κύτταρα εκφράζουν μόνο την HAS 2 ισομορφή, της οποίας τα επίπεδα έκφρασης αυξάνονται κατα τη χορήγηση των PDGF-BB και TGFB2. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα μας προτείνουν την ύπαρξη ενός αυτοκρινούς βιολογικού μονοπατιού στα κύτταρα ινοσαρκώματος το οποίο μπορεί να ρυθμίζει, μέσω της έκκρισης των αυξητικών παραγόντων την αύξηση συγκεκριμένων ισομορφών HAS, την βιοσύνθεση του υαλουρονικού οξέος, καθώς επίσης την έκκριση και την κατανομή του στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία. Το μονοπάτι αυτό έχει την ικανότητα να καθορίζει τη σύσταση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, η οποία είναι σημαντική για τον ρυθμό ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, την διηθητική τους ικανότητα και την μετανάστευση. Μια από τις πιο σημαντικές μεμβρανικές πρωτεογλυκάνες για το ινοσάρκωμα και άλλες μορφές καρκίνου είναι η οικογένεια των συνδεκανών. Οι συνδεκάνες παίζουν σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στη μετανάστευση και στη κυτταρική διήθηση τόσο στα καρκινικά όσο και στα φυσιολογικά κύτταρα. Η οικογένεια περιλαμβάνει τέσσερις πρωτεογλυκάνες τις συνδεκάνες-1, -2, -3 και -4. Μελετήσαμε τη δράση της συνδεκάνης-1 στον πολλαπλασιασμό και στη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων ινοσαρκώματος. Συγκεκριμένα, τα B6FS κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως το βιολογικό μας μοντέλο. Τα B6FS εκφράζουν μη ανιχνεύσιμες ποσότητες συνδεκάνης-1 και -3 , ενώ εκφράζουν χαμηλές ποσότητες συνδεκάνης-2 και υψηλες ποσότητες συνδεκάνης-4, με ανάλυση FACS. Η συνδεκάνη-1 παίρνει μέρος στην κυτταρική διαίρεση, στη διαφοροποίηση και στη μετανάστευση των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων. Επίσης, μελέτες έχουν δείξει ότι τόσο η κυταροπλασματική όσο και η εξωκυττάρια συνδεκάνης-1 παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετάδοση του σήματος σε βιολογικά μονοπάτια. Υπερέκφραση της συνδεκάνης-1 και μόνο του κυταροπλασματικού τμήματος της είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του ρυθμού ανάπτυξης και την μετανάστευσης των κυττάρων B6FS που εκφράζουν τεχνητά συνδεκάνη-1 (transfected) συγκρινόμενα με τα κυτταρα ελέγχου. Επίσης, η τεχνητή έκφραση μιας ομάδας πέντε αμινοξέων RMKKK η οποία βρίσκεται στο συντηριμένο κυτταροπλασματικό κομμάτι της συνδεκάνης-1 είχε ως αποτέλεσμα τη μετακίνηση της συνδεκάνης-1 στον πυρήνα του κυττάρου. Συμπερασματικά τα διαφορετικά τμήματα της συνδεκάνης-1 ελέγχουν διαφορετικά τόσο τη κατανομή της συνδεκάνης στο κύτταρο όσο και τον ρυθμό ανάπτυξής του και τη μεταναστευτική του ικανότητα. Στη συνέχεια μελετήσαμε τη δράση των πρωτεογλυκανών/ γλυκοζαμινογλυκανών στη μιτογονική ικανότητα του PDGF-BB. Ο PDGF-BB επάγει την αυτοκρινή ανάπτυξη των κυττάρων ινοσαρκώματος. Επίσης, είναι γνωστό οτι ο PDGF-BB αλληλεπιδρά με τις πρωτεογλυκάνες μέσω των γλυκοζαμινογλυκάνων που είναι προσδεμένες στον πρωτεινικό κορμό τους. Σε αυτή τη μελέτη εξετάσαμε την επίδραση των ενδογενών και εξωγενώς προστιθέμενων γλυκοζαμινογλυκάνων στη μιτογονική ικανότητα του PDGF-BB σε δύο κυτταρικές σειρές ινοσαρκώματος (HT1080 και B6FS). Χρησιμοποιήθηκαν εξωγενώς προστιθέμενες αλυσίδες θειικής χονδροιτίνης, θειικής δερματάνης, θειικής ηπαρίνης και υαλουρονικό οξύ, ρυθμιστές της ενδογενούς παραγωγής γλυκοζαμινογλυκάνων (π.χ. β- Dxyloside/ sodium chlorate) και ειδικές γλυκοσιδάσες που κόβουν τις μεμβρανικές γλυκοζαμινογλυκάνες. Ο PDGF-BB είχε μια σημαντική αύξηση στον ρυθμό ανάπτυξης των κυτταρικών σειρών ινοσαρκώματος. Ταυτόχρονη χορήγηση αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης και PDGF-BB είχε ως αποτέλεσμα την ενίσχυση της μιτογονικής δράσης του PDGF-BB μέσω των PDGF υποδοχέων. Στη συνέχεια μελετήσαμε την επίδραση των αλυσίδων θειικής χρονδροιτίνης στην επαγώμενη από τον PDGF-BB κινητικότητα των κυττάρων , την χημειοταξία, την μετανάστευση και τη διήθηση των κυττάρων ινοσαρκώματος. Οι αλυσίδες θειικής χονδροιτίνης επάγουν την επαγόμενη από τον PDGF-BB κινητικότητα των κυττάρων , την χημειοταξία, την μετανάστευση και τη διήθητική τους ικανότητα μέσω της αύξησης της φωσφορυλίωσης του PDGF Rβ υποδοχέα. Στη συνέχεια μελετήσαμε την επίδραση των ενδογενών και εξωγενών αλυσίδων θειικής χονδροιτίνης, θειικής δερματάνης, θειικής ηπαρίνης και υαλουρονικού οξέος στον επαγώμενο απο τον PDGF-BB πολλαπλασιασμό, στην μετανάστευση και στην χημειοταξία των φυσιολογικών ινοβλαστών DLF. Η εξωγενώς χορήγηση αλυσίδων θειικής χονδροιτίνης είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή του ρυθμού ανάπτυξης των ινοβλαστών. Όμοια ήταν τα αποτελέσματα με την αύξηση της βιοσύνθεσης των αλυσίδων θειικής χονδροιτίνης μετά απο χορήγηση β- D-xyloside. Ενώ, η αφαίρεση των ενδογενών αλυσίδων θειικής χονδροιτίνης μετά τη χορήγηση χονδροιτινάσης ABC είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του επαγώμενου από τον PDGF-BB ρυθμό ανάπτυξης, της χημειοταξίας και της μετανάστευση των φυσιολογικών ινοβλαστών μέσω της μείωσης της φωσφορυλίωσης του PDGF Rβ υποδοχέα. Ένα από τα πιο σημαντικά συμπεράσματα αυτής της μελέτης είναι η διαφορετική δράση των πρωτεογλυκανών/αλυσίδων θειικής χρονδροιτίνης στον PDGF-BB ρυθμό ανάπτυξης, στη χημειοταξία και στη μετανάστευση των φυσιολογικών ινοβλαστών και των κυττάρων ινοσαρκώματος μέσω της μείωσης ή της αύξησης της φωσφορυλίωσης του PDGF Rβ υποδοχέα, αντίστοιχα. (EL)
Fibrosarcoma is an uncommon tumor with a rich extracellular matrix, there are no specific biomarkers for its diagnosis. Versican, a large chondroitin sulphate proteoglycan and hyaluronan (HA), a non-sulphated glycosaminoglycan are major constituents of the pericellular matrix. Inmany neoplastic tissues, changes in the expression of versican and HAaffect tumour progression. In this study, it was analysed the synthesis of versican and hyaluronan by fibrosarcoma cells, and document how the latter is affected by PDGF-BB, bFGF and TGFB2, growth factors endogenously produced by these cells. Fibrosarcoma cell lines B6FS and HT1080were utilised and compared with normal lung fibroblasts (DLF). The major versican isoforms expressed by DLF and B6FS cells were V0 and V1. Treatment of B6FS cells with TGFB2 showed a significant increase ofV0 and V1mRNAs. Versican expression in HT1080 cells was not significantly affected by any of the growth factors. In addition, TGFB2 treatment increased versican protein in DLF cells. HA, showed approximately a 2-fold and a 9-fold higher production in DLF cells compared to B6FS and HT1080 cells, respectively. In HT1080 cells, HA biosynthesis was significantly increased by bFGF, whereas, in B6FS cells it was increased by TGFB2 and PDGF-BB. Furthermore, analysis of HA synthases (HAS) expression indicated that HT1080 expressed similar levels of all three HAS isoforms in the following order: HAS2N HAS3N HAS1. bFGF shifted that balance by increasing the abundance of HAS1. The major HAS isoform expressed by B6FS cells was HAS2. PDGFBB and TGFB2 showed the most prominent effects by increasing both HAS2 and HAS1 isoforms. In conclusion, these growth factors modulated, through upregulation of specific HAS isoforms, HA synthesis, secretion and net deposition to the pericellular matrix. Syndecan-1 is suggested to participate in the regulation of a number of cellular processes such as cell proliferation and migration. Recent studies have suggested the putative mechanisms of synmdecan-1 cytoplasmic, transmembrane and extracellular domain action on cell functions and signal transduction. The aim of this study was to investigate the effect of specific syndecan-1 domains on fibrosarcoma cell migration and proliferation. Transfected B6FS fibrosarcoma cells with full length (FL/EGFP)of syndecan-1 construct, a variant coding for the endodomain (77/EGFP) and a variant coding for the RMKKK cytoplasmic sequence, were used. The expression and cellular localization of the FL, 77 and RMKKK recombinant proteins was analysed using confocal microscopy, after six weeks selection using geneticin (400μg/ml). Recombinant FL/EGFP showed cell membrane reactivity while RMKKK/EGFP showed distinct nuclear localization. The overexpression of 77/EGFP that lacks the ectodomain resulted in altered morphology, the cells became smaller and rounded. The proliferation of transfected fibrosarcoma cells with the respective constructs was measured using WST-1 colorimetric reagent. Our results demonstrated that the expression of both full length and the two truncated recombinant proteins, compared to vector transfected cells, significantly inhibited fibrosarcoma cell proliferation. B6FS transfected with the 77/ EGFP and the RMKKK/EGFP constructs lack the ectodomain of syndecan-1, enhancing the suggestion that the syndecan-1 ectodomain is responsible for the stimulation of proliferation.Furthermore, we studied the effect of FL/EGFP, the endodomain 77/EGFP and the cytoplasmic RMKKK/EGFP recombinant proteins on the migrative response of B6FS fibrosarcoma cells. Our results demonstrated that B6FS cells transfected with FL/EGFP and RMKKK/EGFP constructs had an enhanced migration capability compared to EGFP vector transfected cells. In contrast, the expression of 77/EGFP recombinant protein inhibited B6FS cell migration. This study suggets that syndecan-1 ectodomain may have a “switch” function , resulting in activation of the cytoplasmic domain, after ligand binding. Platelet derived growth factor is involved in the autocrine growth stimulation of malignant cells, the stimulation of angiogenesis and the recruitment and regulation of tumor fibroblasts. PDGF has been shown to physically interact with glycosaminoglycans which are abundant in the fibrosarcoma cell microenvironment. Aim of the present study was to examine the effects of glycosaminoglycans on the mitogenic function of platelet derived growth factor in two human fibrosarcoma cell lines (B6FS, HT1080). For this purpose exogenously added glycosaminoglycans, regulators of endogenous glycosaminoglycan synthesis (sodium chlorate as selective inhibitor and β- D--xyloside as a stimulator) and specific glycosidases to cleave cell-associated glycosaminoglycans, were utilized. Platelet derived growth factor demonstrated a growth stimulating effect on B6FS, whereas no effect was evident on HT1080 fibrosarcoma cells. β-D-xyloside had no effect on the basal level or the platelet derived growth factor-induced cell proliferation, whereas sodium chlorate severely reduced the basal level of proliferation in both cell lines. Significant co-stimulatory effects of chondroitin sulfate A in combination with platelet derived growth factor BB on the growth of HT1080 and B6FS cells were found. The co-stimulatory effect of chondroitin sulfate A was not due to transcriptional up regulation of platelet derived growth factor receptors genes, but rather to more efficient signalling of tyrosine kinase receptors. In conclusion, this study shows that chondroitin sulfate A can enhance the mitogenic activity of platelet-derived growth factor in fibrosarcoma cells utilizing a pathway which involves tyrosine kinases. This result introduces a new modulating role for chondroitin sulfate in signalling pathways critical for cancer growth. Additionally, the effect of chondtoitin sulphate A on PDGF-BB induced proliferation, and migration of normal fibroblasts was examined.The aim of the present study was to examine the involvement of CS on PDGF-BB induced proliferative responses and receptor activation in human lung fibroblasts. The addition of exogenous free CS chains caused a significant downregulation of the PDGF-BB mediated mitogenic and chemotactic responses. Similar results were obtained by the increase of endogenous CS biosynthesis after β-D-xyloside treatment. Furthermore, removal of the membrane-bound CS chains by selective enzymatic treatment significantly increased the proliferative capacity of human fibroblasts. Analysis of PDGF-R phosphorylation in the presence of CS or β-D-xyloside, demonstrated a reduction of PDGF-Rβ phosphorylation in the tyrosine residue 1021. These results demonstrate, for the first time, that CS either soluble or surface bound downregulates the mitogenic responses of PDGF-BB in normal human lung fibroblasts through the reduction of PDGF-Rβ phosphorylation. Matrix adhesion signals by regulating the assembly of the actin cytoskeleton and the associated integrin adhesion complexes play a key role in cell motility and chemotaxis. Fibrosarcoma is an uncommon soft tissue tumor whose cell microenvironment is rich in ECM components and particularly in glycosaminoglycans/proteoglycans (GAGs/ PGs). In this study the role of chondroitin sulfate (CS) was investigated on fibrosarcoma cell adhesion, motility and migration, utilizing exogenous CS treatment, chondroitinase digestions as well as specific modulators of CS synthesis. Cleavage of cell-associated CS as well as specific inhibition of endogenous CS production severely impaired these fibrosarcoma cell functions. Treatment with free CS chains enhanced cell motility and chemotaxis, whereas adhesion was inhibited. When inhibitors of the main cellular signaling pathways regulating actin cytoskeleton rearrangements were applied, CS chains were found to upregulate cell motility through the MAPK pathway, specifically through JNK, whereas CS-induced chemotaxis was found to require tyrosine kinase dependent pathways. This study introduces a new crucial role of CS chains on tumor cell adhesion, motility and chemotaxis. Summarizing, this study introduces a new role of chondroitin sulfate A in the regulation of proliferation,adhesion, migration and chemotaxis of both fibrosarcoma and normal fibroblasts through tyrosine kinases and JNK signaling pathways. (EN)

Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
text

Hyaluronic Acid
Υαλουρονικό οξύ
Cell Physiology

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Greek

2008-04-03


Σχολή/Τμήμα--Ιατρική Σχολή--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)