Εισαγωγή: Οι ταξάνες είναι μια ομάδα χημειοθεραπευτικών με πολύ θετικά αποτελέσματα στη θεραπεία διάφορων νεοπλασιών. Η κύρια δράση των ταξανών είναι η σύνδεσή τους στην β-τουμπουλίνη η οποία είναι υπομονάδα των μικροσωληνίσκων. Ως αποτέλεσμα έχουμε αλλαγή της δυναμικής και σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων, η οποία οδηγεί σε ακινητοποίηση των κυττάρων στην G2/M φάση του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα τελικά πεθαίνουν μέσω διάφορων οδών.
Η δράση της υπερθερμίας στα κύτταρα εξαρτάται από την κυτταρική σειρά, την ένταση και τη διάρκεια της. Σε ήπια υπερθερμία προκαλείται αναστολή της έκφρασης πολλών γονιδίων και επαγωγή της έκφρασης heat-shock πρωτεϊνών. Γενικά αυξάνεται η διαπερατότητα των κυτταρικών μεμβρανών και αναστέλλεται ο κυτταρικός κύκλος. Σε συνθήκες αυξημένης έντασης και διάρκειας της υπερθερμίας τα κύτταρα οδηγούνται σε απόπτωση ή νέκρωση.
Αρκετές in vitro και in vivo μελέτες έχουν δείξει ότι ο συνδυασμός χημειοθεραπείας και υπερθερμίας είναι αποτελεσματικότερος, απ' ότι η κάθε αγωγή μόνη της, πιθανά ενεργώντας συνεργιστικά ή προσθετικά. Υπάρχουν όμως αντικρουόμενα δεδομένα όσον αφορά στη συνεργιστική δράση της υπερθερμίας στην κυτταροτοξικότητα των ταξανών.
Ως εκ τούτου, μελετήσαμε in vitro το μηχανισμό δράσης της πακλιταξέλης, της υπερθερμίας και τον συνδυασμό τους σε διάφορες κυτταρικές σειρές, σε συνθήκες που ισχύουν στην διεγχειρητική υπέρθερμη ενδοπεριτοναϊκή χημειοθεραπεία.
Υλικά-Μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν οι κυτταρικές σειρές HeLa (ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα τράχηλου μήτρας), MCF-7 (ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα μαστού) και SK-OV-3 (ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα ωοθηκών). Το σχήμα της χημειοθεραπείας που εφαρμόσαμε, προσομοιάζει τις συνθήκες που εφαρμόζονται στη διεγχειρητική υπέρθερμη ενδοπεριτοναϊκή χημειοθεραπεία (Continuous Hyperthermic Peritoneal Perfusion Chemotherapy, CHPPC): επώαση των κυττάρων για 2 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις (5-20 μΜ) πακλιταξέλης σε θερμοκρασία 37°C, 41,5°C, ή 43°C και στη συνέχεια την καλλιέργειά τους στους 37^ σε κανονικές συνθήκες ανάπτυξης για αρκετές ημέρες. Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας προσδιορίστηκαν το δυναμικό πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ο αριθμός των ζωντανών, νεκρών και αποπτωτικών κυττάρων, τα ποσοστά της κατανομής των κυττάρων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου, η μορφολογία του πυρήνα και οι βλάβες του πυρηνικού φακέλου.
Για τη μέτρηση των ζωντανών και νεκρών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε χρώση με Trypan Blue και μέτρηση με το αιματοκυτταρόμετρο Malassez. Το ποσοστό των κυττάρων στις φάσεις του κυτταρικού κύκλου μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (FACS), αφού έγινε πρώτα χρώση του DNA των κυττάρων με ιωδιούχο προπίδιο (PI).O προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος (απόπτωση) εκτιμήθηκε αρχικά παρατηρώντας στο μικροσκόπιο φθορισμού το βαθμό συμπύκνωσης του DNA των κυττάρων μετά από χρώση με DAPI. Κατόπιν χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία TUNEL και μέτρηση των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Το δυναμικό πολλαπλασιασμού των κυτταρικών καλλιεργειών εκτιμήθηκε με το αντιδραστήριο MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazol blue). Η μορφολογία του πυρήνα και οι βλάβες του πυρηνικού φακέλου εκτιμήθηκαν μετά από χρώση του πυρηνικού φακέλου με ειδικά αντισώματα, ανοσοφθορισμό και παρατήρηση των δειγμάτων στο συνεστιακό μικροσκόπιο.
Αποτελέσματα: Επώαση των κυττάρων στους 41,5^ (ήπια υπερθερμία) προκάλεσε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε όλες τις κυτταρικές σειρές, χωρίς όμως να σημειωθεί μείωση του αρχικού κυτταρικού πληθυσμού (κυτταροστατική δράση). Όταν τα κύτταρα επωάστηκαν στους 43^ παρατηρήθηκε κυτταροστατική δράση για την κυτταρική σειρά SKOV-3, ενώ μετρήθηκε μείωση του αρχικού κυτταρικού πληθυσμού (κυτταροτοξική δράση) στα HeLa και MCF-7 κατά 30% και 60% αντίστοιχα. Η υπερθερμία δεν διαφοροποίησε την κυτταροτοξική ή την ήπια κυτταροστατική δράση της πακλιταξέλης που σημειώθηκε στα κύτταρα HeLa ή SK-OV-3, αντίστοιχα. Στα κύτταρα MCF-7 η πακλιταξέλη είχε κυτταροστατική δράση στους 37^ και 41,5^ και κυτταροτοξική δράση στους 43^ (μείωση του αρχικού πληθυσμού κατά 50% στους 43ορ.
Η νέκρωση των κυττάρων προσδιορίστηκε αμέσως μετά το τέλος της εφαρμογής του θεραπευτικού σχήματος (άμεση νέκρωση) και ανά 24ωρο κατά την διάρκεια της καλλιέργειας η οποία διήρκεσε 7 ημέρες (απώτερη νέκρωση). Η άμεση νέκρωση διαπιστώθηκε ότι εξαρτάται αναλογικά από την συγκέντρωση της πακλιταξέλης και το ύψος της θερμοκρασίας. Η υπερθερμία έδειξε ότι έχει κυτταροτοξικές ιδιότητες και ότι δρα συνεργιστικά με την πακλιταξέλη (μέχρι 80% νέκρωση στα κύτταρα HeLa). Στη συνέχεια των πειραμάτων επιλέχθηκε σχήμα που πλησιάζει πιο πολύ στην κλινική πράξη και περιελάμβανε συγκέντρωση πακλιταξέλης 10μM και υπερθερμίας στους 41,5^. Στη μελέτη της απώτερης νέκρωσης φάνηκε ότι η υπερθερμία δεν επηρεάζει τη δράση της πακλιταξέλης. Τα κύτταρα MCF-7 παρουσίασαν το μικρότερο ποσοστό νέκρωσης (30% νεκρών κυττάρων μετά 7 ημέρες), ενώ τα SK-OV-3 παρουσίασαν ποσοστά νέκρωσης 70% στις 7 ημέρες και τα HeLa τα μεγαλύτερα ποσοστά νέκρωσης (80% στις 3 ημέρες).
Όταν χορηγήθηκε πακλιταξέλη παρατηρήθηκε μικρός βαθμός απόπτωσης και σε διαφορετικό ποσοστό για κάθε κυτταρική σειρά: Στα κύτταρα HeLa το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων κυμάνθηκε στο 18%, στα SK-OV-3 στο 20%, ενώ στα MCF-7 δεν παρατηρήθηκε απόπτωση. Η συνδυασμένη εφαρμογή πακλιταξέλης και υπερθερμίας δεν επηρέασε τα παραπάνω ποσοστά.
Στη μελέτη της κατανομής των κυττάρων στις τρεις κύριες φάσεις του κυτταρικού κύκλου μετά από κάθε θεραπευτικό σχήμα βρήκαμε ότι σε όλες τις κυτταρικές σειρές η πακλιταξέλη ακινητοποιεί τα κύτταρα στην G2/M σε ποσοστό πάνω από 60% για τουλάχιστον 3 ημέρες. Η επιπλέον εφαρμογή της υπερθερμίας επηρέασε μόνο τα MCF-7 κύτταρα, στα οποία παρατηρήθηκε καθυστέρηση στη μετάβαση και ακινητοποίηση τους στην G2/M φάση του κυτταρικού κύκλου.
Από την ανάλυση του υποπληθυσμού των G2/M κυττάρων διαπιστώσαμε ότι ο αποτελούνταν από μεταφασικά και πολυπύρηνα κύτταρα. Κατά την πρόοδο της καλλιέργειας των κυττάρων παρατηρήθηκε αύξηση των πολυπύρηνων κυττάρων με ανάλογη μείωση των μιτωτικών κυττάρων (εκτός των MCF-7). Η υπερθερμία καθυστερεί τη μετάβαση των κυττάρων στη μίτωση, όχι όμως και τον σχηματισμό των πολυπύρηνων κυττάρων. Τελικά, σε όλες τις κυτταρικές σειρές μετά από 5 ημέρες καλλιέργειας ο υποπλυθησμός των G2/M κυττάρων βρέθηκε ότι αποτελείται κυρίως από πολυπύρηνα κύτταρα.
Η μελέτη της μορφολογίας των κυττάρων ανέδειξε συσσώρευση των πυρηνικών πόρων, ελλείμματα του πυρηνικού φακέλου και παρουσία πολλαπλών μιτωτικών αστέρων μικροσωληνίσκων σε όλα τα θεραπευτικά σχήματα που περιείχαν πακλιταξέλη. Τα παραπάνω ευρήματα δεν επηρεάστηκαν από την εφαρμογή της υπερθερμίας.
Συμπέρασμα: Χρησιμοποιώντας in vitro ένα σχήμα σύντομης χορήγησης πακλιταξέλης, υπερθερμίας και τον συνδυασμό αυτών, το οποίο μοιάζει αρκετά με εκείνο που εφαρμόζεται κλινικά στην περιοχική χημειοθεραπεία (CHPPC), βρήκαμε σε κυτταρικές σειρές ότι η υπερθερμία δεν εμποδίζει τη δράση της πακλιταξέλης και ότι η αιτία του κυτταρικού θανάτου είναι κυρίως η νέκρωση. Δεδομένης της ανεξάρτητης δράσης της υπερθερμίας σε σχέση με την πακλιταξέλη σε κυτταρικό επίπεδο, σε συνδυασμό με τα πλεονεκτήματα που προσφέρει η υπερθερμία στην περιοχική χημειοθεραπεία, συμπεραίνουμε ότι η πακλιταξέλη θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στην
CHPPC.
(EL)
Background: Taxanes are plant alkaloids commonly used in the treatment of human carcinomas. They bind with high affinity to the β-subunit of tubulin, causing decreased dynamic instability and increased microtubule rigidity, leading to mitotic blockade. The cellular effects of the drug vary, depending on dose and treatment scheme. The cells usually die due to apoptosis.
In vitro the cellular effect of hyperthermia depends on the duration and the level of temperature used. Apart from the temperature administered and the histological cellular characteristics of the tissue, the survival curve is influence by several factors including hypoxia, pH and blood flow. The influences of all these factors ultimately cause apoptosis or necrosis.
Conflicting results have been reported from in vitro and in vivo studies on the combination of paclitaxel with hyperthermia. These studies varied in drug concentration, exposure time, degree and duration of hyperthermia and cell type studied.
During Continuous Hyperthermic Peritoneal Perfusion Chemotherapy, (CHPPC) for primary or secondary peritoneal malignancies, tumour cells are exposed to high drug concentrations for a relatively short period of time. We investigated in vitro the effect of paclitaxel and hyperthermia on cell proliferation, cell cycle kinetics and cell death under conditions resembling those during CHPPC.
Methods: Human breast MCF-7, ovarian SK-OV-3 and cervical HeLa cells were exposed to 10 and 20 μM paclitaxel at 37, 41.5 or 43C for 2 h.
After the various treatments cell proliferation was determined using MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazol blue). Cell cycle analysis was done after the cells were treated in order to stain the DNA using the DNAPrep Coulter Reagent Kit (Beckman Coulter). Samples were subjected to FACS in a Coulter Epics Elite. The number of alive and dead cells was determined by incubating a fraction of total cells with Trypan Blue, placing the cell suspension in a Neubauer hemocytometer and counting the number of cells which incorporated (dead) or excluded (alive) the dye under a conventional microscope. Apoptosis was assayed by TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) assay. TUNEL assays were performed using an in situ cell death detection kit obtained from Boehringer Mannheim. All samples were analyzed by flow cytometry (FACS) in a Coulter Epics Elite.
Results: Hyperthermia alone exerted a cytostatic effect to all cell lines (stable initial cell population) and at 430C a cytotoxic effect on MCF-7 and HeLa cells (a decrease of initial cell population at 30% and 60% respectively). Hyperthermia did not alter the cytotoxic effect of paclitaxel on HeLa cells. (50% decrease of the initial population). Hyperthermia also did not influence the mild cytostatic effect of paclitaxel on SK-OV-3 cells. Paclitaxel exerted a cytostatic effect on the MCF-7 cells at 370C, 41.50C and a cytotoxic at 43 0C (50% decrease of the initial population)
At the first 24h hyperthermia showed an additive effect on cell necrosis at all cultures (up to 80% on HeLa cells). After 24h this effect was diminished. The MCF-7 cells were necrotic at 30% after 7 days, the SK-OV-3 at 70% after 7 days and the HeLa cells at 80% after 2 days.
Apoptosis as a result of the treatments was minimal and did not affected by hyperthermia. HeLa cells were apoptotic at 18% after 3 days and SK-O-V3 cells at 20% after 5 days. The MCF-7 cells did not exert any apoptotic cells.
MCF-7, HeLa and SK-OV-3 cells treated under normothermic conditions with paclitaxel were arrested at G2/M or M phase for a minimum 60% for at least 3 days. Hyperthermia at 41.50C altered cell cycle distribution and affected the paclitaxel-related effect on cell cycle kinetics of MCF-7 cells (43% of the cells at G2/M phase after 3 days).
The subpopulation of G2/M cells consisted of mitotic and multinucleated cells. A direct (proportional) relationship between the decrease of the number of mitotic cells and the appearance of multinucleated cells was observed (except of the MCF-7 cells). When paclitaxel was combined with hyperthermia this balance between mitotic and multinucleated cells was disturbed, without stopping the formation of multinucleated cells. After 5 days the majority of the cells of the subpopulation G2/M were multinucleated at all cell lines.
All the cells after exposure to paclitaxel showed nuclear envelope structural defects and abnormalities due to aberrant cytokinesis (gaps on the nuclear envelop integrity, nuclear pore clusters, multinucleated cells and asters of microtubules). The above effects did not influenced by the presence of hyperthermia.
Conclusions: Hyperthermia did not inhibit the effect of paclitaxel on the studied carcinoma cell lines and the main cause of cellular death was necrosis. Given that hyperthermia has an additive effect on the cells studied and the advantages of the hyperthermia in vivo, we can say that the use of paclitaxel in the CHPPC is feasible.
(EN)
