Η θερμοκρασία αποτελεί ένα πολύ σημαντικό περιβαλλοντικό παράγοντα που συμβάλλει στην αφθονία των ειδών και στη γεωγραφική τους κατανομή. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, η προσαρμογή των εξώθερμων οργανισμών στο φαινόμενο της υπερθέρμανσης του πλανήτη έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας προκειμένου να γίνουν κατανοητοί οι μηχανισμοί με τους οποίους οι οργανισμοί ανταποκρίνονται στις αυξημένες θερμοκρασίες. Καθώς τα ψάρια αποτελούν μια μεγάλη ομάδα εξώθερμων, η ευαισθησία των πρώιμων οντογενετικών τους σταδίων μπορεί να μεταβάλει σε μόνιμη ή προσωρινή βάση την ανάπτυξη και την επιβίωση τους μέσω της φαινοτυπικής πλαστικότητας. Με τον όρο φαινοτυπική πλαστικότητα χαρακτηρίζεται το φαινόμενο κατά το οποίο ένας γονότυπος μπορεί να εμφανίσει περισσότερους του ενός φαινοτύπους, όταν εκτίθεται σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες κατά την ανάπτυξη.
Εντός του θερμοκρασιακού εύρους του κάθε είδους, η θερμοκρασία επηρεάζει την απόδοση των ψαριών σε πολλά επίπεδα της βιολογικής οργάνωσης. Σε κάποια είδη ψαριών, η θερμοκρασία ανάπτυξης έχει αναγνωριστεί ως βασικός παράγοντας καθορισμού του φύλου, της ανατομίας των μυών, του σχήματος σώματος, των μεριστικών χαρακτήρων, του χρονισμού των οντογενετικών γεγονότων, της δυνατότητας για εγκλιματισμό και της κολυμβητικής ικανότητας. Παρά τη μέχρι τώρα καλά μελετημένη επίδραση της θερμοκρασίας στην καρδιά των αναπτυσσόμενων ψαριών, από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη εργασία που παρουσιάζει το προγραμματισμό του σχήματος της καρδιάς από την θερμοκρασία του πρώιμου περιβάλλοντος.
Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην ανατομία της καρδιάς, και στην κολυμβητική ικανότητα του zebrafish, μετά από κάποιους μήνες μετά το τέλος της επίδρασης των διαφορετικών συνθηκών. Σε δευτερεύον επίπεδο, στόχος ήταν η μελέτη της γονιδιακής έκφρασης πέντε γονιδίων-δεικτών αναδιαμόρφωσης της καρδιάς καθώς και η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα σώματος και στη γονιμότητα του zebrafish. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήσαμε το zebrafish ως κατάλληλο οργανισμό μοντέλο καθώς είναι ένα είδος με έντονη φαινοτυπική πλαστικότητα έναντι της θερμοκρασίας ανάπτυξης ενώ ταυτόχρονα εμφανίζει ίδιο πρότυπο οντογένεσης με την πλειοψηφία των τελεόστεων.
Αβγά zebrafish από κοινό απόθεμα γεννητόρων διαμοιράστηκαν σε τρεις θερμοκρασίες ανάπτυξης (24, 28 και 32 °C) μέχρι τη μεταμόρφωση, και μετά παρέμειναν σε κοινές συνθήκες (28 °C) μέχρι την ενηλικίωση. Η μελέτη της ανατομίας της καρδιάς πραγματοποιήθηκε μέσω micro-ct απεικόνισης στο τέλος της επίδρασης των διαφορετικών συνθηκών και στο ενήλικο στάδιο. Η κρίσιμη ταχύτητα κολύμβησης (Ucrit) χρησιμοποιήθηκε ως αξιόπιστος δείκτης μέτρησης της αερόβιας κολυμβητικής ικανότητας για το στάδιο του ιχθυδίου και το ενήλικο στάδιο μετά από 20 και 100 μέρες εγκλιματισμού στις κοινές συνθήκες (28 °C) αντίστοιχα. Οι μετρήσεις του σχήματος σώματος έλαβαν μέρος μετά από τον υπολογισμό της κρίσιμης ταχύτητας κολύμβησης για το κάθε ψάρι. Η γονιδιακή έκφραση μελετήθηκε στο τέλος της εφαρμογής των κοινών συνθηκών και μετά από 20 μέρες εγκλιματισμού στις κοινές συνθήκες. Τα πειράματα μελέτης της επίδρασης της θερμοκρασίας
ανάπτυξης στη γονιμότητα του zebrafish πραγματοποιήθηκαν στο ενήλικο στάδιο, 180 και 300 μέρες μετά το τέλος της εφαρμογής των διαφορετικών συνθηκών.
Ως προς το σχήμα της καρδιάς, αύξηση της θερμοκρασίας ανάπτυξης συνδέθηκε με πιο κυκλικό σχήμα κοιλίας στα αρσενικά (μείωση κατά 22% του VL/VD), αλλά όχι στα θηλυκά zebrafish. Ως προς τους υπόλοιπους προς εξέταση μορφολογικούς χαρακτήρες της καρδιάς των ενηλίκων, η θερμοκρασία ανάπτυξης προκάλεσε έντονες φυλο-εξαρτώμενες διαφορές. Στους 32 °C τα θηλυκά άτομα εμφάνισαν σημαντικά πιο μακρόστενη κοιλία από τα αρσενικά της ίδιας θερμοκρασιακής συνθήκης (αύξηση κατά 22% του VL/VD). Το μήκος του αρτηριακού βολβού των αρσενικών που μεγάλωσαν στους 28 °C βρέθηκε υψηλότερο από των θηλυκών της αντίστοιχης θερμοκρασιακής συνθήκης (αύξηση κατά 7% του BaL/SL). Ο σχετικός όγκος της κοιλίας των αρσενικών στους 24 και 28 °C ήταν σημαντικά μεγαλύτερος από των θηλυκών των αντίστοιχων θερμοκρασιών (αύξηση κατά 26% του VeV/SL στους 24 °C και στους 28 °C των αρσενικών έναντι των θηλυκών). Ο σχετικός όγκος του αρτηριακού βολβού βρέθηκε και αυτός σημαντικά υψηλότερος στα αρσενικά των 28 και 32 °C σε σχέση με τα θηλυκά των αντίστοιχων θερμοκρασιών (αυξημένος BuLV/SL στα αρσενικά κατά 22% στους 28 °C και κατά 19% στους 32 °C).
Στα ιχθύδια, ως προς το σχήμα της καρδιάς, παρατηρήθηκε σημαντική επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (μείωση κατά 10% του VL/VD με την αύξηση της θερμοκρασίας). Ως προς τους υπόλοιπους υπό εξέταση μορφολογικούς χαρακτήρες της καρδιάς, παρατηρήθηκαν αποκρίσεις εγκλιματισμού έναντι της θερμοκρασίας ανάπτυξης. Με την αύξηση της θερμοκρασίας, μειώθηκε το μήκος του αρτηριακού βολβού (μείωση κατά 12% του BaL/SL) καθώς και ο σχετικός όγκος της κοιλίας και του αρτηριακού βολβού (μείωση κατά 45% του VeV/SL και του BuLV/SL).
Η θερμοκρασία ανάπτυξης επέδρασε σημαντικά στην κρίσιμη ταχύτητα κολύμβησης των ενήλικων zebrafish. Στα αρσενικά, αύξηση της θερμοκρασίας ανάπτυξης από τους 24 στους 32 °C οδήγησε σε μείωση της κρίσιμης ταχύτητας κολύμβησης κατά 16%. Στα θηλυκά, τα άτομα που μεγάλωσαν στους 32 °C είχαν σημαντικά πιο χαμηλή κρίσιμη ταχύτητα κολύμβησης από τα άτομα των 24 και των 28 °C (μείωση κατά 25% και κατά 30% αντίστοιχα). Η επίδραση του φύλου αποδείχτηκε σημαντική σε όλες τις υπό εξέταση θερμοκρασίες με τα αρσενικά να επιτυγχάνουν υψηλότερες τιμές κρίσιμης ταχύτητας κολύμβησης έναντι των θηλυκών (αυξημένη RUcrit κατά 16% στους 24 °C, κατά 7% στους 28 °C και κατά 26% στους 32 °C στα αρσενικά). Στα ιχθύδια, η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης δεν αποδείχτηκε σημαντική αν και η ύπαρξη μιας ανάλογης τάσης δεν μπορεί να παραβληθεί.
Η μελέτη της γονιδιακής έκφρασης στο τέλος της επίδρασης των διαφορετικών θερμοκρασιών αποκάλυψε σημαντική υπερέκφραση στη χαμηλότερη θερμοκρασία ανάπτυξης (24 °C) του nppa (κατά 16 φορές περισσότερη από τους 28 °C), του myh7 (κατά 74 φορές μεγαλύτερη από τους 28 °C), του mybpc3 (κατά 9 φορές μεγαλύτερη από τους 28 °C ) και του actinb2 (κατά 4 φορές μεγαλύτερη σε σχέση με τους 32 °C). Μετά από 20 μέρες εγκλιματισμού σε κοινές συνθήκες (28 °C), οι διαφορές στα περισσότερα γονίδια εξομαλύνθηκαν, ενώ παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης των γονιδίων nfatc1 και mybpc3 στους 24 °C ως προς την τιμή αναφοράς των 28 °C (κατά 3 και 2 φορές μικρότερη, αντίστοιχα).
Ως προς το σχήμα σώματος των ενηλίκων, η θερμοκρασία ανάπτυξης επέδρασε σημαντικά στο σχήμα σώματος των αρσενικών, διαφοροποιώντας την ομάδα των 24 °C από τις ομάδες των 28 και 32 °C. Τα αρσενικά που αναπτύχθηκαν στους 24 °C εμφάνισαν πιο υδροδυναμικό σχήμα σε σχέση με τις υπόλοιπες ομάδες. Αντίστοιχα στα θηλυκά, η θερμοκρασία ανάπτυξης επέδρασε σημαντικά, διαφοροποιώντας τα άτομα που μεγάλωσαν στους 32 °C από τα άτομα που μεγάλωσαν στους 24 και 28 °C. Τα θηλυκά άτομα των 32 °C εμφάνισαν αισθητά πιο διογκωμένη κοιλία από τις υπόλοιπες ομάδες. Στα ιχθύδια, η θερμοκρασία ανάπτυξης διαφοροποίησε σημαντικά το σχήμα σώματος των ατόμων που μεγάλωσαν στους 32 °C σε σχέση με αυτά που μεγάλωσαν στους 24 °C και στους 28 °C. Τα άτομα των 32 °C είχαν λιγότερο βαθειά κοιλία σε σχέση με τις υπόλοιπες ομάδες.
Ως προς την πλαστικότητα της γονιμότητας των θηλυκών zebrafish έναντι της θερμοκρασίας ανάπτυξης, τα αποτελέσματα έδειξαν πως η σχετική γονιμότητα των θηλυκών ατόμων αυξάνει στις χαμηλές (24 °C) έναντι των υψηλών (32 °C) θερμοκρασιών ανάπτυξης (αύξηση κατά 40% του EggsT/W). Στη δεύτερη πειραματική επανάληψη τα αποτελέσματα δεν επιβεβαιώθηκαν στατιστικά.
Τα ευρήματα της παρούσας εργασίας αποδεικνύουν πως η θερμοκρασία των πρώιμων οντογενετικών σταδίων προκαλεί μόνιμες αλλαγές στη καρδιά και την κολύμβηση των ενηλίκων. Δεδομένης της μεγάλης οικολογικής σημασίας που έχει η κρίσιμη ταχύτητα κολύμβησης για τους φυσικούς πληθυσμούς (μετανάστευση, αποφυγή θήρευσης, θρέψη), τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υποδεικνύουν τις πιθανές αποκρίσεις της υπερθέρμανσης του πλανήτη και των εποχιακών διακυμάνσεων στους πληθυσμούς των ψαριών. Εκτός από τα ψάρια, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ θα μπορούσαν να αφορούν και τις πιθανές πλαστικές αποκρίσεις της καρδιάς των υπόλοιπων εξώθερμων οργανισμών (αμφίβια, ερπετά).
(EL)
Temperature has long been recognized as a major environmental factor contributing to species abundance and geographical distribution. During the last decades, ectotherms’ adaptation to global change is becoming of crucial importance to better understand the diversity of adaptive mechanisms in response to temperature increase. As fish constitute a large group of ectotherms, the susceptibility of their embryonic and larval stages to temperature fluctuations can permanently or temporarily alter growth and survival through phenotypic plasticity. The term phenotypic plasticity, characterizes the ability of a single genotype to produce a variety of phenotypes, as a response to the different environmental stimuli experienced during development.
Within the zone of tolerance, temperature affects fish performance at a variety of levels of biological organization. In some fish species, developmental temperature has already been proven as an acute regulating factor in sex determination, muscle anatomy, body shape, meristic characters, developmental progress, thermal acclimation capacity and swimming performance. Despite the significance of water temperature for the cardiac function in developing fish, to our knowledge, this is the first study demonstrating the programming of cardiac shape by the temperature which was experienced by the fish during embryonic and larval stages.
The purpose of this study was to determine the acute and prolonged changes of cardiac anatomy and swimming performance in response to developmental temperature, several months after exposure to different thermal regimes. On a secondary level, we intended to study the expression of five marker genes involved in heart remodeling, as well as the effect of developmental temperature on zebrafish body shape and relative fecundity. We used the zebrafish as an experimental model since it’s characterized by a variety of plastic responses against developmental temperature and has the same ontogenetic pattern of development with most teleost fish.
Zebrafish embryos were subjected to three developmental temperature treatments (TD = 24, 28 or 32 °C) up to metamorphosis and then all maintained under common conditions (28° C) up to adulthood. Cardiac anatomy measurements were assessed via micro-ct imaging, at the end of the different treatments and at the adult stage. Critical swimming speed (Ucrit) was used as a reliable indicator of aerobic swimming performance. Swimming performance assays took place at the juvenile and adult stages, after 20 and 100 days of acclimation at the common conditions (28 °C). After the swimming performance assays, fish body shape measurements took place. Gene expression analysis was assessed at the end of the different treatment period and after 20 days of acclimation at the common conditions (28 °C). The effect of developmental temperature on zebrafish relative fecundity was measured at the adult stage at 180 and 300 days after the end of the different exposure period.
The elevation of TD induced a significant increase of the ventricle roundness in male (22% decrease of VL/VD ratio), but not in female zebrafish. Sex-related differences were evident in the rest of the under-study morphometrical characters of the zebrafish heart. At 32 °C, females exhibited more elongated ventricles than males of the same temperature treatment (22% increase of VL/VD ratio). Bulbus arteriosus length of males raised at 28 °C was longer than of females raised at the same temperature (7% increase of BaL/SL in males). Relative ventricular volume of males at 24 and 28 °C was significant bigger than of females of the same temperature treatments (26% increase in VeV/SL in both temperature treatments). Bulbus arteriosus relative volume was also found bigger in males of 28 and 32 °C as opposed to females of the same temperature treatments (22% increase of BuLV/SL in males raised at 28 °C and 19% increase in males raised at 32 °C). Developmental temperature exhibited significant effects on the juvenile heart shape (elevation of TD induced a 10% reduction in VL/VD ratio). As for the rest of the heart morphometrics, juveniles exhibited significant acclimation responses to developmental temperature. The elevation of TD resulted in shorter bulbus arteriosus length (12% reduction of BaL/SL) and to a significant reduction of the relative ventricular and bulbus arteriosus volume (45% reduction in VeV/SL and BuLV/SL).
Adults reared at different developmental temperatures exhibited significant differences in critical swimming speed velocities. In males, elevation of TD from 24 to 32 °C resulted in reduction of critical swimming speed by 16%. Females raised at 32 °C exhibited significant lower swimming capacity as opposed to females at 24 and 28 °C (25% and 30% reduction respectively). Sex-related responses were evident in all temperature treatments where males achieved higher velocities than females (16% increase of RUcrit 24 °C, 7% increase of RUcrit at °C, and 26% increase at 32 °C). In juveniles the effect of temperature on swimming performance was not significant but the existence of a similar trend with adults cannot be omitted.
Gene expression analysis that was performed at the end of the temperature treatments revealed significant up-regulation at colder temperatures (24 °C) of nppa (16-fold higher expression levels than 28 °C), myh7 (74-fold higher expression levels than 28 °C), mybpc3 (9-fold hogher expression levels than 28 °C) and actinb2 (4-fold higher experession levels than 32 °C). After 20 days of acclimation at the common conditions (28 °C), differences in most of the genes studied were normalized, while there was a significant up-regulation of nfatc1 and mybpc3 genes at 28 °C opposed to 24 °C (increase of gene expression by 3- and 2-fold, respectively).
Developmental temperature had a significant effect on male body shape, inducing significant differences between the 24 °C group and the 28 and 32°C groups. Males raised at 24 °C had more slender bodies as opposed to the rest of the groups. In females, developmental temperature had also a significant effect on body shape, inducing significant differences between the 32 °C group and the 24 and 28°C groups. Females raised at 32 °C had more swollen bellies as compared to rest of the temperature groups. In juveniles, developmental
temperature induced significant differences between the 32 °C group and the 24 and 28 °C groups. Juveniles raised at 32 °C appeared to have more slender bodies.
With regards to thermal plasticity of fecundity, female zebrafish that were raised at lower developmental temperatures (24 °C) exhibited higher relative fecundity than females raised at high developmental temperatures (32 °C). Results were not confirmed statistically at the second experimental replicate.
Our data show that rises in water temperature at critical early life stages can have detrimental effects on cardiac anatomy and physical capacity of adult fish. Given that critical swimming speed has a vital ecological significance for fish populations (i.e. for migration, foraging, feeding) our findings have relevance to fish populations and the concerns of global warming and seasonal temperature perturbations. Besides fish, our results could also have implications to the plastic responses of other ectothermic vertebrates.
(EN)
