Οι μονοοξυγενάσες Baeyer-Villiger (BVMOs) τύπου Ι αποτελούν μέλη της οικογένειας των
φλαβοπρωτεϊνικών μονοοξυγενασών, οι οποίες διαθέτουν ως προσθετική ομάδα το φλάβινο
αδένινο δινουκλεοτίδιο (FAD). Καταλύουν, κυρίως, αντιδράσεις εναντιοεκλεκτικής μετατροπής
κετονών σε εστέρες ή λακτόνες, εισάγοντας ένα άτομο οξυγόνου δίπλα σε μία κετο-ομάδα του
υποστρώματος. Σπανιότερα, καταλύουν σουλφοξειδώσεις, εποξειδώσεις ή οξυγονώσεις
ιωδιδίων, σεληνίου και βορικών οξέων. Οι BVMOs βρίσκουν εφαρμογή στον τομέα της
βιοϊατρικής, όπου δύναται να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή βιοδιασπώμενων ραμμάτων,
εμφυτευμάτων και άλλων πολυμερών ενδιαφέροντος, όμως, η έλλειψη σταθερότητας που τις
χαρακτηρίζει καθυστερεί τη χρήση τους σε ευρεία κλίμακα. Συγκεκριμένα, οι BVMOs
παρουσιάζουν χαμηλή σταθερότητα σε υψηλές θερμοκρασίες, μεταβολές pH και είναι
ευαίσθητες σε οξειδωτικό στρες και οργανικούς διαλύτες.
Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας αποτέλεσε ο βιοχημικός χαρακτηρισμός τριών
μονοοξυγενασών, από τους μικροοργανισμούς Acinetobacter sp., Pseudomonas putida και
Arthrobacter sp., καθώς και η βελτιστοποίηση των διεργασιών που σχεδιάζονται με αυτές.
Αρχικά, εκφράστηκαν τα ένζυμα, πραγματοποιώντας καλλιέργειες σε κύτταρα E. coli BL21 (DE3),
και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας χρωματογραφία συγγένειας. Ακολούθως, προσδιορίστηκε
η ειδική ενεργότητά τους, η σταθερότητα σε διαφορετικές θερμοκρασίες και συνθήκες pH και
τέλος, η σταθερότητά τους παρουσία συνδιαλύτη (DMSO), ακολουθώντας πρωτόκολλο
φωτομετρικής αντίδρασης. Στη συνέχεια, με εφαρμογή ορθολογικής μεταλλαξιγένεσης,
επιλέχθηκαν σημειακές μεταλλάξεις για τα ένζυμα από Acinetobacter sp. Και Pseudomonas
putida, με στόχο την απομάκρυνση, από το ενεργό κέντρο, αμινοξέων που είναι ευαίσθητα στην
οξείδωση. Τρία από τα πέντε μεταλλάγματα που δημιουργήθηκαν εκφράστηκαν και, μετρώντας
την ειδική τους ενεργότητα, βρέθηκε πως μόνο ένα εξ αυτών διέθετε καταλυτική ικανότητα. Το
μετάλλαγμα αυτό χαρακτηρίστηκε, ομοίως με τα ένζυμα φυσικού τύπου, και αποδείχθηκε πως
παρουσίαζε βελτιωμένη σταθερότητα. Επιδιώκοντας την περαιτέρω αύξηση της σταθερότητας
του μεταλλάγματος, κυρίως σε υψηλότερες θερμοκρασίες, πραγματοποιήθηκε τυχαία
μεταλλαξιγένεση, από την οποία προέκυψαν τρεις βιβλιοθήκες μεταλλαγμάτων. Η εργασία
ολοκληρώθηκε με τη διεξαγωγή στατιστικής ανάλυσης για τις βιβλιοθήκες και την επιλογή της
βέλτιστης βιβλιοθήκης, με σκοπό την αναζήτηση νέων, σταθερότερων μεταλλαγμάτων.
(EL)
University of Crete
