In the present thesis, a study of human insulin’s (Human insulin-HI) polymorphism was carried out under different crystallization conditions by X-ray crystallography. For this purpose, numerous insulin crystallization experiments were conducted in the pH range 4.5-8.5 in the presence of small organic ligands as the paracetamol and the pterostilbene but also in the absence of these. The resulting crystals were used in X-ray diffraction experiments performed at the European Synchrotron, ESRF, France (ID22 Beamline) and at the X'Pert Pro (PANalytical) laboratory diffractometer. The data collection from both sources had a very good match with each other. The technique employed for the X-Ray diffraction experiments was the X-ray Powder Diffraction (XRPD), which has been proven to be an important tool for the determination of polycrystalline protein precipitants during the last decade. In this study, 3 polymorphs of insulin were obtained, characterized by 2 different symmetries, hexagonal and cubic, and each crystalline phase was determined at the level of the unit cell symmetry and dimensions. The alterations in the unit cell parameters from one configuration to the other while pH increasing was of particular interest. The results of this study demonstrate the efficiency and accuracy of the XRPD method for polymorph screening and structure refinement in a range of macromolecular crystallization conditions.
When HI was crystallized in absence of ligands, three crystalline phases were observed. At acidic pH range (5-6.5) the insulin configuration is T6, at higher pH values (6.5-7.7) the configuration alters to T3R3f and at more alkaline pH values (7.8 and 8.5) the crystalline symmetry transforms completely to cubic I213. When HI was co-crystallized with paracetamol, in the pH range (5-8) a hexagonal symmetry R3 occurs, and insulin obtains the T3R3f configuration , whereas for pH values higher than 8, symmetry alters completely to cubic T3R3f. Finally, for HI crystallized with pterostilbene, at acidic pH values (5.4-6.3) the insulin configuration is T6 and at higher values (6.6-7.1) alters to T3R3f. In the samples with the highest pH values (7.4-8.3), the crystalline symmetry is totally altered in cubic I213. Among the various polymorphs obtained, a novel cubic insulin-free polymorph has been identified with unit cell parameters which have not been published before and thus their three dimensional structures have been deposited by our team in the Protein Data Bank (Karavasili et al., 2018).
The effects of small organic ligands on the structure and function of HI is an area that attracts high scientific interest worldwide aiming to enhance the pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles of insulin-based drugs. In the present study, HI was crystallized with paracetamol, which has sedative and analgesic effects, and also was cocrystallized with the polyphenol pterostilbene,which is a plant derivative with antioxidant, antidiabetic and beneficial effects in general.
Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία πραγματοποιήθηκε μελέτη του πολυμορφισμού της ανθρώπινης ινσουλίνης (human insulin-HI) σε διαφορετικές συνθήκες κρυστάλλωσης μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πολυάριθμα πειράματα κρυστάλλωσης της HI σε εύρος τιμών pH από 4.5 έως 8.5 περίπου παρουσία των μικρών οργανικών προσδετών παρακεταμόλη και πτεροστιλβένη αλλά και απουσία αυτών. Οι κρύσταλλοι που προέκυψαν χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα περίθλασης ακτίνων-Χ τα οποία πραγματοποιήθηκαν στο Ευρωπαϊκό σύγχροτρον, ESRF, της Γαλλίας (Πειραματικός σταθμός ID22) καθώς και στο εργαστηριακό περιθλασίμετρο X’Pert Pro (PANalytical). Τα δεδομένα που συλλέχθησαν και από τις δύο πηγές είχαν πολύ καλή ταύτιση μεταξύ τους. Η τεχνική που ακολουθήθηκε για τα πειράματα περίθλασης ήταν η X-ray Powder Diffraction (XRPD), η οποία τα τελευταία χρόνια έχει αναδειχθεί σε ένα σημαντικό εργαλείο χαρακτηρισμού πρωτεϊνικών πολυκρυσταλλικών ιζημάτων. Από τη μελέτη αυτή, προέκυψαν 3 πολύμορφα της HI που χαρακτηρίζονται από 2 διαφορετικές κρυσταλλικές συμμετρίες, την εξαγωνική και την κυβική ενώ πραγματοποιήθηκε ο προσδιορισμός κάθε κρυσταλλικής φάσης στο επίπεδο της μοναδιαίας κυψελίδας. Ενδιαφέρον παρουσίασε η μεταβολή των πλεγματικών σταθερών από τη μια διαμόρφωση στην άλλη με την αύξηση του pH. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής επιδεικνύουν την αποδοτικότητα και ακρίβεια της μεθόδου XRPD για διαλογή πολυμόρφων και επίλυση δομών σε ένα εύρος συνθηκών κρυστάλλωσης μακρομορίων.
Κατά την μελέτη HI κρυσταλλωμένης απουσία προσδετών παρατηρούνται τρεις διακριτές κρυσταλλικές φάσεις. Σε σχετικά όξινο pH (5-6.5) το μόριο κρυσταλλώνει σε εξαγωνική συμμετρία R3 και η μοριακή διαμόρφωση είναι T6 , σε υψηλότερες τιμές pH(6.5-7.7) η διαμόρφωση αλλάζει σε T3R3f και σε τιμές pH (7.8 και 8.5) η κρυσταλλική συμμετρία μεταβάλλεται σε κυβική Ι213. Για το σύμπλοκο ινσουλίνης με παρακεταμόλη, σε εύρος pH περίπου 5-8 παρατηρείται εξαγωνική συμμετρία R3, με T3R3f διαμόρφωση της HI ενώ σε τιμές pH υψηλότερες του 8, η συμμετρία αλλάζει ολοκληρωτικά σε κυβική T3R3f. Τέλος για την ινσουλίνη συγκρυσταλλωμένη με πτεροστιλβένη σε σχετικά όξινο pH (5.4-6.3) η διαμόρφωση της ινσουλίνης είναι T6 ενώ σε υψηλότερες τιμές pH(6.6-7.1) η διαμόρφωση αλλάζει σε T3R3f. Στα δείγματα με τις υψηλότερες τιμές pH (7.4-8.3) η κρυσταλλική συμμετρία μεταβάλλεται ολοκληρωτικά σε κυβική Ι213. Ανάμεσα στα πολύμορφα που εντοπίσθηκαν, μεγάλο ενδιαφέρον είχε το κυβικό πολύμορφο ινσουλίνης χωρίς προσδέτη που χαρακτηρίζεται κρυσταλλογραφικά από πλεγματικές σταθερές που δεν είχαν καταχωρηθεί στην διεθνή τράπεζα πρωτεϊνικών δομών (Protein Data Bank) όπου και κατατέθηκε (Karavasili et al., 2018).
Οι επιδράσεις των μικρών οργανικών μορίων στη δομή και τη λειτουργία της HI είναι μια περιοχή που προσελκύει μεγάλο επιστημονικό ενδιαφέρον παγκοσμίως, λόγω της δυνατότητας ενίσχυσης των φαρμακοκινητικών και φαρμακοδυναμικών προφίλ των φαρμάκων με βάση την HI . Στην παρούσα μελέτη, η ΗΙ συγκρυσταλλώθηκε με παρακεταμόλη που έχει καταπραϋντικές και αναλγητικές δράσεις καθώς και με την πολυφαινόλη πτεροστιλβένη, φυτικό παράγωγο με αντιοξειδωτικές, αντιδιαβητικές και γενικευμένα ευεργητικές δράσεις.
