Η ετεροδιμερική ιντερλευκίνη-15 (hetIL-15) είναι μία κυτταροκίνη που υποστηρίζει τον πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των κυττάρων φυσικών φονέων (ΝΚ) και των Τ κυτταροτοξικών κυττάρων. Αποτελείται από μία διαμεμβρανική πολυπεπτιδική αλυσίδα (IL-15 υποδοχέας α), η οποία αλληλοεπιδρά και σταθεροποιεί την βιοενεργή πολυπεπτιδική αλυσίδα (IL-15). Αυτό το σύμπλεγμα φθάνει στην κυτταρική μεμβράνη, όπου απελευθερώνεται ως βιοενεργή ετεροδιμερική κυτταροκίνη (hetIL-15), κατόπιν πρωτεολυτικής αντίδρασης. Η ανασυνδυασμένη IL-15 και άλλες μορφές της κυτταροκίνης έχουν φανεί ότι οδηγούν στον πολλαπλασιασμό Τ κυττάρων με κυτταροτοξικό φαινότυπο εκτελεστών-μνήμης, και αυξημένη κυτταροτοξική ενεργότητα. Η hetIL-15 και άλλες μορφές της IL-15 έχουν επίσης δείξει θεραπευτική αποτελεσματικότητα σε μοντέλα καρκίνου σε ποντίκια. Η hetIL-15 έχει εισέλθει σε κλινικές δοκιμές για θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου, χορηγούμενη υποδορίως σε σταθερές δόσεις. Στην τοξικολογική μελέτη σε σιμιΐους Macaca mullata (μακάκους), η hetIL- 15 χορηγούμενη σε υψηλές δόσεις εμφάνισε τοξικότητα νωρίς στον θεραπευτικό κύκλο, ενώ η ανοσολογική ενεργοποίηση μειωνόταν προς το τέλους του κύκλου, υποστηρίζοντας την ανάγκη βελτιστοποίησης του θεραπευτικού σχήματος. Η δυνατότητα της hetIL-15 να πληθαίνει τα κυτταροτοξικά κύτταρα την καθιστά ελκυστική για θεραπευτική χρήση σε λοίμωξη από τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV-1), ιδιαίτερα αν τα ενεργοποιημένα κύτταρα διεισδύουν σε ιστούς που αποτελούν την ιϊκή δεξαμενή, όπως τα λεμφαδενικά θυλάκια και τον λεμφικό ιστό σχετιζόμενο με τον γαστρεντερικό σωλήνα (GALT). Για την θεραπεία κακοηθειών, η αποτελεσματικότητα της IL-15 και άλλων φαρμάκων έχουν φανεί να είναι σημαντικές όταν επιτυγχάνεται στόχευση εντός των όγκων. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα εκκρίνουν κυστίδια μεγέθους ~100 nm (εξωκυτταρικά κυστίδια, EV), τα οποία δύναται να διαμορφωθούν ώστε να φέρουν θεραπευτικά μόρια. Στο εκκολαπτόμενο πεδίο των θεραπευτικών EV, αυτά τα κυστίδια σχεδιάζονται ως βιολογικά νανοσωματίδια με σκόπο την μεταφορά πολλαπλών θεραπευτικών μορίων σε όγκους και άλλους ιστούς.
>>Στόχοι: Η παρακάτω μελέτη έχει ως σκοπό: (α) την ανάπτυξη βελτιστοποιημένου δοσολογικού σχήματος της hetIL-15, βασιζόμενο στον μηχανισμό δράσης της κυτταροκίνης, ώστε να ελαχιστοποιηθεί η τοξικότητα και να μεγιστοποιηθεί η ανοσολογική ενεργοποίηση, (β) την διερεύνηση της εφαρμοσιμότητας της hetIL-15 ως μέρος ανοσοθεραπευτικής προσέγγισης της θεραπείας λοίμωξης HIV-1, και (γ) την ανάπτυξη των απαραίτητων τεχνολογιών και εργαλείων για την περαιτέρω χρήση των EV ως πλατφόρμα για την μεταφορά της hetIL-15 και άλλων θεραπευτικών μορίων εντός κακοήθων όγκων.
>>Μεθοδολογία: Υγιείς και μολυσμένοι με ιο SHIV μακάκοι υποβλήθηκαν σε θεραπευτικό κύκλο 2 εβδομάδων με αυξανόμενες δόσεις hetIL-15 (2 εώς 64 μg/kg, step-dose), χορηγούμενη υποδορίως ή ενδοπεριτοναϊκά. Τα ζώα θανατώθηκαν στο πέρας της μελέτης. Αίμα συλλέχθηκε καθόλη τη διάρκεια της μελέτης, βιοψίες λεμφαδένων (LN) πάρθηκαν πριν και μετά του θεραπευτικού κύκλου, και δείγματα από πολλαπλά όργανα (συμπεριλαμβανομένου του γαστρεντερικού σωλήνα) ελήφθησαν κατά την νεκροψία. Ζωτικά σημεία, κλινικοεργαστηριακές εξετάσεις, κλινική παρατήρηση, και καθορισμός των φαρμακολογικών επιπέδων της hetIL-15 διεξήχθησαν καθόλη τη διάρκεια της μελέτης. Τα δείγματα ιστών αναλύθηκαν ώς προς την συχνότητα και τον φαινότυπο των ανοσολογικών κυττάρων με κυταρομετρία ροής ή/και με πολυπαραμετρική συνεστιακή μικροσκοπία με ποσοτικοποίηση παρατηρήσεων (Histocytometry). Το ϊικό φορτίο του πλάσματος, καθώς και τα ϊικά νουκλεϊνικά οξέα σχετιζόμενα με κύτταρα ιστών, ποσοτικοποιήθηκαν με qPCR και RT-qPCR χρησιμοποιώντας εκκινητήρες για το γονίδιο SIV gag.
Για της μελέτες με EV, δημιουργήθηκε μια νέα μορφή της κυτταροκίνης με την χρήση τεχνολογίας ανασυνδυασμού, η οποία αποτελείται από πρωτεΐνη-σύντηξης των ανθρώπινων hetIL-15 και Lactadherin. Δημιουργήθηκαν κλώνοι της κυτταρικής σειράς HEK293 οι οποίοι μονίμως εκκρίνουν είτε την φυσικού-τύπου κυτταροκίνη ή hetIL-15/Lactadherin, και αναπτύχθηκαν σε καλλιεργητικές φλάσκες ή σε βιοαντιδραστήρα με κοίλες ίνες (με καλλιερητικό μέσω χωρίς ζωικό ορό). EV απομονώθηκαν από το εμπλουτισμένο (από τις κυτταροκαλλιέργειες) καλλιεργητικό μέσω χρησιμοποιώντας συνδυασμούς υπερ(φυγοκέντρησης), διήθησης, διάλυσης, διήθησης εγκάρσιας ροής, και χρωματογραφίας αποκλεισμού μεγέθους. Τα καθαρά EV που προκύπταν αναλύονταν ως προς βιοφυσικές ιδιότητες (ανάλυση ανίχνευσης νανοσωματιδίων, ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης), ως
προς βιοχημικές ιδιότητες (Western, ELISA, κυτταρομετρία ροής, ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης με ανοσο-ανίχνευση, φασματογραφία μάζας), και ως προς την βιοενεργότητα in vitro. Η κυτταρική πρόσληψη EV μελετήθηκε in vitro καλλιεργώντας κυτταρικές σειρές ή μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος με φθοριο-σεσημασμένα EV, παρουσία ή απουσία αναστολέων πρόσληψης, και αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Η βιοκατανομή φθοριο-σεσημασμένων EV κατόπιν ενδοφλέβιας έγχυσης μελετήθηκε σε υγιή ποντίκια FVB και σε Balb/c που φέραν όγκους 4T1, και αναλύθηκε με εικονοληψία φθορισμού σε ζωντανά ποντίκια, καθώς και στα απομονωμένα όργανα τους ex vivo.
>>Αποτελέσματα: Το υποδόριο σχήμα step-dose οδήγησε σε λιγότερη τοξικότητα από ότι η χορήγηση σταθερής δόσης 50 μg/kg hetIL-15. Η τοξικότητα αφορούσε σε παροδικό εμπύρετο και μείωση της λευκωματίνης ορού. Επιπλέον, ο πολλαπλασιασμός και η ανοσολογική ενεργοποίηση των κυτταροτοξικών κυττάρων διατηρήθηκε καθόλη τη διάρκεια του θεραπευτικού κύκλου. Το σχήμα ήταν ανεκτό εξίσου καλά σε μακάκους μολυσμένους από SHIV, και οδήγησε σε σημαντική διείσδυση των λεμφαδένων (συμπεριλαμβανομένων των θυλακίων) με πολλαπλασιάζοντα κυτταροτοξικά κύτταρα. Η ενδοπεριτοναϊκή έγχυση της hetIL-15 σε μικρό αριθμό ζώων δεν σχετίστηκε με αυξημένη τοξικότητα, και οδήγησε σε βελτιωμένη ανοσολογική ενεργοποίηση εντώς των μεσεντερικών λεμφαδένων και GALT. Τα ζώα που υπέστησαν στο υποδόριο σχήμα υποβλήθηκαν επιπλέον σε ιολογικές αναλύσεις. Το ιϊκό φορτίο πλάσματος μειώθηκε σε 11 από τα 13 ζώα (3 εώς 176-πλάσια μείωση), όπως και το ιικό RNA στα λεμφαδενικά κύτταρα (10 εώς 103-πλάσια μείωση) και στα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (3 εώς 100-πλάσια μείωση) σε 4 από τα 4 αναλυθέντα ζώα.
Παρατηρήσαμε ότι η ανθρώπινη hetIL-15/Lactadherin αύξησε την παρουσία της κυτταροκίνης σχετιζόμενης με EV κατά 100 φόρες, συγκρινόμενη με την φυσικού-τύπου κυτταροκίνη, και ότι η κυτταροκίνη σχετιζόμενη με τα EV ήταν βιοενεργή in vitro, οδηγώντας στον δοσο- εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό της κυτταρικής σειράς ΝΚ92. Το εμπλουτισμένο καλλιεργητικό μέσο από τον βιοαντιδραστήρα εμπεριείχε 40-60 φορές περισσότερα EV ανά μονάδα όγκου σε σχέση με αυτό από τις συμβατικές καλλιεργητικές φλάσκες, και δεν περιείχε πρόσμιξη πρωτεϊνών ζωικού ορού. Ο συνδυασμός διήθησης εγκάρσιας ροής με την χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους απεδείχθη μεθοδολογία ικανή να παράγει μεγάλες ποσότητες καθαρών, βιενεργών EV. Τα ενδοφλεβίως χορηγούμενα EV απομακρύνονταν γρήγορα από τα ηπατικά μακροφάγα των ποντικών. Ανακαλύψαμε πως ο Υποδοχέας Ρακοσυλλέκτης Τύπου Α είναι υπεύθυνος για μεγάλο μέρος της απομάκρυνσης, και αναδείξαμε ότι o αποκλεισμός του υποδοχέα με θειική δεξτράνη μειώνει την ηπατική απομάκρυνση και αυξάνει σημαντικά την κυκλοφορία και την συσσώρευση των χορηγούμενων EV εντός όγκων.
>>Συμπεράσματα: Η χορήγηση hetIL-15 με αυξανόμενες δόσεις (step-dose) σε μακάκους Rhesus αποτελεί ασφαλή τρόπο χορήγησης υψηλών δόσεων της κυτταροκίνης, οδηγώντας σε σημαντικές αυξήσεις της διείσδυσης κυτταροτοξικών κυττάρων στους ιστούς του σώματος, συμπεριλαμβανομένων των ανατομικών τοποθεσιών με σημασία για την θεραπεία HIV-1 και κακοηθειών. Στα μολυσμένα με SHIV ζώα, το υποδόριο σχήμα της hetIL-15 οδήγησε σε μείωση του ιϊκού φορτίου σχετιζόμενο με το αίμα και τους περιφερικούς λεμφαδένες, όμως δεν οδήγησε στην εξάλειψη της λοίμωξης. Η βελτίωση των επιδράσεων της hetIL-15 στους υπόλοιπους ιστούς της ιϊκής δεξαμενής (όπως στους μεσεντερικούς λεμφαδένες και GALT), και η ενσωμάτωση της hetIL-15 σε θεραπευτικό πρωτόκολλο που περιλαμβάνει επιπλέον σκευάσματα (πχ. ουσίες αναστροφής της λανθάνουσας φάσης του HIV-1, αναστολείς σημείων ελέγχου) πιθανώς θα αυξήσει την πιθανότητα επίτευξης λειτουργικής ίασης της λοίμωξης HIV- 1.
Παρόμοιες προσεγγίσεις, που να αξιοποιούν την δραστικότητα της hetIL-15 σε συνδυαστικά πρωτόκολλα μπορεί να είναι αποτελεσματικά και στην θεραπεία κακοηθειών. Η στοχευμένη στους όγκους μεταφορά της κυτταροκίνης με χρήση EV που φέρουν μεγάλες ποσότητες της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης-σύντηξης hetIL-15/Lactadherin επίσης μπορεί να αυξήσει την θεραπευτική αποτελεσματικότητα. Η χρήση του πλασμιδίου που σχεδιάσαμε να κωδικοποιεί την ανθρώπινη Lactadherin μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αύξηση επιπλέον θεραπευτικών πρωτεϊνών σε ΕV. Η παραγωγή καθαρών EV από βιοαντιδραστήρα με την χρήση διήθησης εγκάρσιας ροής και χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους είναι αποδοτική μέθοδος για την μελέτη EV στο ερευνητικό εργαστήριο. Επιπλεόν, είναι συμβατή με μεθόδους της ιατροφαρμακευτικής βιομηχανίας (cGMP) και θα μπορούσε να προσαρμοστεί στην μεγάλης- κλίμακας παραγωγής θεραπευτικών EV. Συνεπώς, αυτές οι μέθοδοι μπορεί να είναι ευρέως εφαρμόσιμες στην περαιτέρω μεταφραστική ανάπτυξη των θεραπευτικών EV. Μολονότι η μεταφορά των ΕV σε όγκους μπορεί να περιορίζεται από την απομάκρυνσή τους από τα ηπατικά μακροφάγα κατόπιν ενδοφλέβιας έγχυσης (ιδιαίτερα μέσω αλληλεπίδρασης των ΕV με τους Υποδοχείς Ρακοσυλλέκτες Τύπου Α), ο αποκλεισμός της κυτταρικής πρόσληψης από μακροφάγα είναι εφικτός, και βοηθά την συσσώρευση των EV σε όγκους. Η ανάπτυξη νέων αποκλειστών της κυτταρικής πρόσληψης, η τροποποίηση των EV με μόρια στόχευσης ή απόκρυψης, καθώς και η βαθύτερη κατανόηση των μηχανισμών που καθορίζουν την μοίρα των EV in vivo μπορεί να επιτρέψουν πιο αποτελεσματική μεταφορά.
Καθώς η hetIL-15 μελετάται ήδη σε ανθρώπους, τα ευρήματα των μελετών μας δύναται να καθοδηγήσουν τον σχεδιασμό περαιτέρω κλινικών δοκιμών της εν λόγω κυτταροκίνης για την ανοσοθεραπεία λοίμωξης HIV-1 και κακοηθειών.
Heterodimeric interleukin-15 (hetIL-15) is a cytokine that sustains the growth and activation of NK and cytotoxic T cells. It consists of a membrane-anchored polypeptide (IL-15 receptor α), which interacts and stabilizes the bioactive polypeptide (IL-15). This plasma membrane-anchored complex is cleaved and liberated as a bioactive heterodimeric cytokine (hetIL-15). Recombinant single-chain IL-15 and other forms of the cytokine have been shown to lead to expansion of T cells with an effector-memory, cytotoxic phenotype and enhanced cytotoxic function. hetIL-15 and other forms of IL-15 have also been shown to have anti-tumor effects in mouse models of cancer; hetIL-15 is currently being tested in humans for treatment of metastatic cancer, delivered as fixed-dose subcutaneous injections. In Rhesus macaques, high- dose hetIL-15 led to early toxicity, while immune activation decreased towards the end of treatment cycles, suggesting a need to optimize the treatment regimen. The ability of hetIL-15 to increase the abundance of cytotoxic cells makes it an appealing drug for use in
HIV-1 infection, especially if activated cells infiltrate tissues known to comprise the viral reservoir, such as in lymph node follicles and the gastrointestinal tract-associated lymphoid tissues (GALT). For cancer therapy, the efficacy of IL-15 and other drugs has been shown to be significant when they are targeted to the sites of tumors. Eukaryotic cells secrete ~100 nm vesicles (extracellular vesicles; EV), which can be engineered to carry therapeutic molecules. In the emerging field of EV therapeutics, these vesicles are being designed as biological nanoparticles to deliver multiple therapeutics to tumors and other tissues.
>>Aims: This study sought to: (a) develop an optimized dosing regimen for hetIL-15 based on its mechanism of action, in order to minimize toxicity and maximize immunological activation, (b) explore the use of hetIL-15 as part of an immunotherapeutic approach to treatment of HIV-1 infection, and (c) develop the technology and tools necessary for further development of EV as a platform to deliver hetIL-15 and other therapeutics to tumors.
>>Methods: Healthy and SHIV-infected Rhesus macaques were treated with a 2-week cycle of increasing hetIL-15 dosages (2-64 μg/kg; “step-dose”), either subcutaneously or intraperitoneally. At the end of treatment, animals were sacrificed. Blood was collected throughout the study, lymph nodes (LN) were biopsied before/after treatment, and multiple organs (including the gastrointestinal tract) were sampled at necropsy. Vital signs, blood chemistry, clinical observation, and hetIL-15 drug level measurements were carried out throughout the study. Sampled tissues were analyzed for immune cell frequencies and phenotype by flow cytometry and/or multiplex confocal imaging with Histocytometry. Plasma viral load and cell associated viral burden was measured by qPCR and qRT-PCR using primers for SIV gag.
For EV studies, a new form of the cytokine was generated by recombinant technology, consisting of a human hetIL-15/Lactadherin fusion protein. HEK293 cell clones stably expressing wildtype cytokine or hetIL-15/Lactadherin were generated and grown in tissue culture flasks or in a hollow-fiber bioreactor with serum-free media. EV were purified from conditioned media using combinations of (ultra)centrifugation, filtration, dialysis, tangential flow-filtration, and size exclusion chromatography. EV preparations were characterized biophysically (nanoparticle tracking analysis, transmission electron microscopy), biochemically (Western blot, ELISA, flow cytometry, immuno-transmission electron microscopy, mass spectrometry) and with regard to in vitro bioactivity. Uptake of EV was tested in vitro by culturing cell lines or PBMC with fluorescently labelled EV, in the presence or absence of uptake receptor blockers, and monitored by flow cytometry. In vivo biodistribution of fluorescently labelled EV injected i.v. was tested in healthy FVB and 4T1 tumor-bearing Balb/c mice, and monitored by live fluorescence imaging and ex vivo imaging of excised organs.
>>Results: The subcutaneous step-dose regimen was associated with less toxicity than a fixed-dose administration of 50 μg/kg hetIL-15. Toxicity was limited to transient fever and a decrease in serum albumin. Furthermore, proliferation and immune activation of cytotoxic cells was maintained throughout the treatment cycle. The regimen was equally well tolerated in SHIV-infected macaques, and led to significant infiltration of lymph nodes (including follicles) with proliferating cytotoxic cells. Intraperitoneal administration in a small cohort was not associated with increased toxicity, and led to improved immune activation within the mesenteric LN and GALT. Animals that received s.c hetIL-15 were also tested for virological outcome. Plasma viral load decreased in 11 of 13 treated animals (range 3-176 fold reduction), as did cell- associated viral RNA in LN (10-103 fold reduction) and peripheral blood cells (3-100 fold reduction) in 4 of 4 tested animals.
We found that human hetIL-15/Lactadherin increased cytokine loading of EV by 100 fold over wildtype hetIL-15, and that EV-associated cytokine was bioactive in vitro, leading to dose- dependent proliferation of the NK92 cell line. Bioreactor-conditioned medium contained 40-60 fold more EV per mL than conventional cell culture, and lacked serum contaminants found in conventional cell culture. Combining tangential flow filtration with SEC proved to be a scalable methodology for producing highly purified, bioactive EV . EV administered to mice intravenously were rapidly cleared by liver macrophages. We found Scavenger Receptor A to be an important mediator of this uptake, and showed that blocking it with dextran sulfate led to decreased liver clearance and significantly increased plasma levels and tumor accumulation of administered EV.
>>Conclusions: Administration of hetIL-15 using a step-dose regimen in Rhesus macaques is a safe way to administer high-dose cytokine, leading to significant increases in cytotoxic cell infiltration of tissues throughout the body, including at sites relevant to cancer and HIV-1 infection. In SHIV-infected animals, subcutaneous hetIL-15 therapy led to a decrease in viral burden associated with blood and peripheral LN, but did not eradicate the virus. Augmenting hetIL-15 effects in other reservoir sites (such as mesenteric LN and GALT), and incorporating hetIL-15 into a protocol that combines other agents (e.g. latency reversal agents, checkpoint inhibitors) may increase the likelihood of a functional cure of HIV-1 infection.
Similar approaches, capitalizing on the potent effects of hetIL-15 in combination protocols may also be beneficial in the treatment of cancer. Targeted tumor delivery of the cytokine on EV expressing high amounts of the novel hetIL-15/Lactadherin fusion protein may increase efficacy. Use of our human lactadherin construct could be employed to increase EV loading of other protein therapeutics. Bioreactor production and purification with tangential flow filtration + SEC were not only efficient in lab-scale production of EV for development, but are scalable, cGMP-compatible technologies that could be readily adapted to industrial manufacturing of EV. Thus, these methods may be more broadly applicable to the further translational development of EV therapeutics. While delivery of EV to tumors can be limited by liver macrophage clearance upon i.v. administration (especially by interaction with Scavenger Receptor A), blocking this uptake is possible, and facilitates tumor accumulation of EV. Development of new uptake blocking molecules, EV targeting/stealth modification, as well as a deeper understanding of what determines the fate of EV in vivo may allow for more effective delivery.
As hetIL-15 is already tested in humans, the findings of our studies may direct the design of future clinical trials of this cytokine for immunotherapy of HIV-1 infection and cancer.
