The distinction between the molecule poly-ADP-ribose (PAR) and the poly-A chain 50 years ago, along with the exploration of ADP-ribosylation as a reversible post-translational modification the last 20 years gave new perspectives to the study of different cellular processes. At first, it concerned only the DNA repair and the chromatin remodeling but afterwards it expanded to different processes like the oxidative stress and the immune response. The PARP protein family consists of 17 members and they are the main responsible enzymes for the post-translational modification, the ADP-ribosylation, in eukaryotes. PARPs have a common conserved catalytic domain which catalyzes NAD+ to ADP-r and NAM, synthesizes the polymer poly-ADP-r and can transfer the ADP-r unit or the polymer to another substrate. However, their rest distinct domains impart to each PARP member its uniqueness, regarding their role at the cellular processes. A family of protein domains which is conserved across all the kingdoms of life and it is also a part of three PARPs, namely macroPARPS, is the family macro. The macroPARPs (PARP9/14/15) have multiply tandem macro domains which can recognize different products of ADP-ribosylation. The human PARP9 (hPARP9) naturally is expressed ubiquitously participating in DNA repair, whereas it is over-expressed in chemoresistant cancer tissues and cardiovascular diseases. Moreover, its expression is induced by IFN-γ during an infection. The aim of this particular master dissertation is to study the structure-activity relationship of the macro2 domain (MD2) οf hPARP9 with its natural ligand ADP-r via Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR spectroscopy) in solution, in order to gather information which would contribute to the elucidation of its binding mechanism in atomic level. The obtained information will also be helpful to the clarification of hPARP9MD2’s function in physiological and pathological states. The cDNA of hPARP9MD2 was cloned successfully in the plasmid vector pET28a(+). The hPARP9MD2 was expressed using the heterologous system EXPRESS BL21 (DE3) E.coli. The polypeptide was uniformly labeled with the isotopes 15N or/and 13C according to the requirements of each NMR experiment. The hPARP99MD2 was isolated in high purity with yield 2,1 mg/L bacterial culture (in minimal medium). The stability studies of hPARP9MD2 proved that the binding of ADPr increases the protein domain’s stability. The titration of HPARP9MD2 with the small molecule ADP-r was monitored via NMR spectroscopy and the results indicate an interaction characterized by high affinity. NMR experiments were performed at the complex of hPARP9MD2 with the ADP-r. The preliminary data analysis show that hPARP9MD2 is a folded protein molecule either being at its apo-form or its bound-form. The protein backbone assignment was executed at 73 % due to the signals’ overlapping and the presence of flexible protein regions. The predicted secondary structure of hPARP9MD2 by the program TALOS+, using the NMR assignment data, reveals a “ββαβααββαβαβα” topology which is identical to the secondary structural elements of the apo-form defined via X-ray crystallography. The analysis of the rest multinuclear experiments and the dynamical experiments will contribute to the mapping of the exact binding region and will determine the dynamic of the polypeptide during the binding of the small molecule.
Η διάκριση της αλυσίδας poly-ADP-ribose (PAR) από την αλυσίδα poly-adenine πριν περίπου 50 χρόνια, καθώς και η διερεύνηση της ADP-ριβοζυλίωσης ως αναστρέψιμης μετα-μεταφραστικής τροποποίησης, τα τελευταία 20 χρόνια, οδήγησε στην εμφάνιση νέων προοπτικών στη μελέτη διάφορων κυτταρικών διαδικασιών εστιάζοντας αρχικά στην επιδιόρθωση του DNA και στην οργάνωση της χρωματίνης και συνεχίζοντας προς το πεδίο του οξειδωτικού στρες και της ανοσολογικής απόκρισης. Η οικογένεια των πρωτεϊνών PARP αποτελείται από 17 μέλη και είναι η κύρια υπεύθυνη για την παρουσία αυτής της τροποποίησης στους περισσότερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Οι PARPs αποτελούνται από μία συντηρημένη καταλυτική επικράτεια η οποία είναι υπεύθυνη για τον καταβολισμό του μορίου NAD+ σε ADP-r και ΝΑΜ και συνήθως τη μεταφορά μίας μονάδας ADP-r ή μιας αλυσίδας ADP-r (PAR) σε ένα υπόστρωμα. Ωστόσο αυτό που προσδίδει τη μοναδική λειτουργία και σημασία του κάθε πρωτεϊνικού μέλους στις κυτταρικές διαδικασίες είναι οι υπόλοιπες επικράτειες τους. Μία οικογένεια επικρατειών η οποία φαίνεται να είναι εξελικτικά συντηρημένη σε όλα τα βασίλεια ζωής και είναι μέρος τριών PARP, οι οποίες ονομάζονται macroPARPs, είναι η οικογένεια macro. Οι macroPARPs (PARP9/14/15) διαθέτουν πολλαπλές διαδοχικές macro επικράτειες οι οποίες δύναται να αναγνωρίζουν διαφορετικά προϊόντα της ADP-ριβοζυλίωσης. Η ανθρώπινη PARP9 (hPARP9) εντοπίζεται φυσιολογικά σε όλους τους ιστούς, συμμετέχει στην επιδιόρθωση του DNA, ενώ σε παθολογικές καταστάσεις υπερ-εκφράζεται σε χημειοανθεκτικούς καρκίνους και σε καρδιαγγειακές παθήσεις. Επιπλέον, η έκφρασή της επάγεται από την IFN-γ κατά τη λοίμωξη από παθογόνα. Σκοπός της συγκεκριμένης μεταπτυχιακής εργασίας είναι η μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας της πρωτεϊνικής επικράτειας macro2 (MD2) της hPARP9 με τον φυσικό της προσδέτη ADP-r μέσω φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy-NMR spectroscopy) σε διάλυμα, ώστε να αντληθούν πληροφορίες για την αποσαφήνιση του μηχανισμού πρόσδεσης του μικρού μορίου σε ατομικό επίπεδο. Αυτές θα συνεισφέρουν στη διαλεύκανση της λειτουργίας της σε φυσιολογικές αλλά και παθολογικές καταστάσεις. Το τμήμα DNA το οποίο κωδικοποιεί την hPARP9MD2 κλωνοποιήθηκε επιτυχώς σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης pET28a(+). H hPARP9MD2 εκφράστηκε μέσω χρήσης του ετερόλογου βακτηριακού συστήματος EXPRESS BL21 (DE3) E.coli. Το πολυπεπτίδιο επισημάνθηκε καθολικά με τα ισότοπα των πυρήνων 15Ν ή/ και 13C σύμφωνα με τις εκάστοτε απαιτήσεις του πειράματος NMR. Η hPARP9MD2 απομονώθηκε σε υψηλή καθαρότητα με απόδοση 2,1 mg/L βακτηριακής καλλιέργειας (σε θρεπτικό υλικό ελαχίστων μέσων). Οι μελέτες σταθερότητας της επικράτειας απέδειξαν ότι η δέσμευση του μορίου ADP-r αυξάνει την σταθερότητά της. Η τιτλοδότηση της hPARP9MD2 με το χημικό μόριο ADP-r παρακολουθήθηκε μέσω φασματοσκοπίας NMR και παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση. Πειράματα NMR διεξήχθησαν στο σύμπλοκο της hPARP9MD2 με το ADP-r. Τα δεδομένα από την ανάλυση των πειραμάτων NMR μέχρι στιγμής υποδεικνύουν ένα αναδιπλωμένο πρωτεϊνικό μόριο είτε βρίσκεται στην ελεύθερη είτε στην δεσμευμένη μορφή του. Η ταυτοποίηση των ατόμων του πολυπεπτιδικού σκελετού πραγματοποιήθηκε σε ποσοστό 73 % (λόγω αλληλοεπικάλυψης σημάτων και παρουσίας ευκίνητων περιοχών). Τα προβλεπόμενα δευτεροταγή στοιχεία της hPARP9MD2, μετά την εισαγωγή των χημικών μετατοπίσεων των ατόμων στο διαδικτυακό πρόγραμμα TALOS, αποκαλύπτουν μια «ββαβααββαβαβα» τοπολογία ταυτόσημη με την ελεύθερη κρυσταλλική της δομή. Η ανάλυση των υπολοίπων τριπυρηνικών πειραμάτων και των πειραμάτων δυναμικής θα επιδείξει την ακριβή περιοχή πρόσδεσης και θα συνεισφέρει στη διερεύνηση της δυναμικής συμπεριφοράς του πολυπεπτιδίου κατά την δέσμευση του μικρού μορίου.
