Οι ασθενείς µε αποφρακτικό ίκτερο, ιδιαίτερα όταν εκτίθενται στο επιπρόσθετο stress ενός επεµβατικού διαγνωστικού ή θεραπευτικού χειρισµού, είναι επιρρεπείς στην ανάπτυξη σηπτικών επιπλοκών και νεφρικής δυσλειτουργίας που οδηγούν σε υψηλά ποσοστά νοσηρότητας και θνητότητας. Πειραµατικές και κλινικές µελέτες έχουν δείξει ότι ο αποφρακτικός ίκτερος προκαλεί δυσλειτουργία του βλεννογόνιου εντερικού φραγµού, οδηγώντας σε ενδοτοξιναιµία, η οποία φαίνεται να διαδραµατίζει κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη των επιπλοκών αυτών. Η απουσία χολής µεταβάλλει τη λειτουργία του εντερικού φραγµού χωρίς να διασπά τη συνέχεια του επιθηλίου. Οι µοριακοί µηχανισµοί που ενέχονται στο φαινόµενο αυτό δεν έχουν αποσαφηνιστεί. Η παρούσα διδακτορική διατριβή επιχειρεί να διερευνήσει την επίδραση του πειραµατικού αποφρακτικού ικτέρου στην έκφραση της αποφραξίνης, δοµικού συστατικού των αποφρακτικών ενώσεων, στον εντερικό βλεννογόνο, στην απόπτωση και στον πολλαπλασιασµό των επιθηλιακών κυττάρων στις κρύπτες και στα επίπεδα οξειδωτικού stress στο έντερο. Επιπλέον, σε µια προσπάθεια θεραπευτικής παρέµβασης, διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος των ρυθµιστικών εντερικών πεπτιδίων bombesin (BBS) και neurotensin (NT) στις ανωτέρω παραµέτρους, καθώς και στην ιστολογία και στα επίπεδα οξειδωτικού stress στο ήπαρ. Προηγούµενες µελέτες έχουν δείξει ότι τα πεπτίδια αυτά εξασκούν ένα ευρύ φάσµα δράσεων στον εντερο-ηπατικό άξονα και βελτιώνουν την ακεραιότητα του γαστρεντερικού βλεννογόνου έπειτα από την επίδραση διαφόρων βλαπτικών παραγόντων. Η απουσία χολής ενδοαυλικά, αποστερεί τον εντερικό βλεννογόνο από τις βακτηριοστατικές, αντι-ενδοτοξινικές και τροφικές της ιδιότητες, οδηγώντας σε αύξηση των βακτηριδίων και της ενδοτοξίνης ενδοαυλικά και σε εντερική ατροφία. Οι µεταβολές αυτές προάγουν τη µετακίνηση βακτηρίων και ενδοτοξινών στην πυλαία φλέβα και ακολούθως, µέσω µιας κατασταλµένης εκκαθαριστικής ικανότητας των κυττάρων Kupffer εξαιτίας της χολόστασης, στη συστηµατική κυκλοφορία. Η συστηµατική ενδοτοξιναιµία ενεργοποιεί τη συστηµατική φλεγµονώδη απάντηση, η οποία σχετίζεται µε τη δυσλειτουργία που αναπτύσσεται σε αποµακρυσµένα όργανα, ενώ συνεισφέρει και στην περαιτέρω επιδείνωση της λειτουργίας του εντερικού φραγµού και της ηπατικής βλάβης. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης επιβεβαίωσαν την παρουσία πυλαίας και συστηµατικής ενδοτοξιναιµίας σε εξωηπατική απόφραξη των χοληφόρων. Η προκαλούµενη από τον αποφρακτικό ίκτερο ατροφία του εντερικού βλεννογόνου τεκµηριώθηκε µε µορφοµετρική ανάλυση και µε µετρήσεις του DNA και της πρωτεΐνης. Ένας πιθανός µηχανισµός προαγωγής της ατροφίας του εντερικού βλεννογόνου είναι η διαταραχή της ισορροπίας µεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασµού και κυτταρικού θανάτου στις κρύπτες, µε αύξηση της απόπτωσης και µείωση της µιτωτικής δραστηριότητας. Επίσης, ο αποφρακτικός ίκτερος οδήγησε σε αύξηση του οξειδωτικού stress στο έντερο, όπως τεκµηριώνεται από την αύξηση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων, της οξείδωσης των πρωτεϊνών, της οξειδωµένης γλουταθειόνης (GSSG), των ολικών µη πρωτεϊνικών µεικτών δισουλφιδίων (NPSSR), και των πρωτεϊνικών δισουλφιδίων (PSSP), ενώ µειώθηκε το αντιοξειδωτικό µόριο της ανηγµένης γλουταθειόνης (GSH). Η ενδοτοξιναιµία και οι αυξηµένες συγκεντρώσεις χολικών αλάτων αποτελούν σηµαντικούς διεγέρτες της παραγωγής δραστικών µεταβολιτών οξυγόνου. Η παρουσία οξειδωτικού stress στο έντερο συνεισφέρει στην προαγωγή της αποπτωτικής διεργασίας και στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασµού στις κρύπτες, οδηγώντας σε ατροφία του βλεννογόνου. Ένα άλλο πρωτότυπο εύρηµα αυτής της µελέτης είναι η διαταραχή του παρακυττάριου φραγµού του εντέρου στα πειραµατόζωα µε αποφρακτικό ίκτερο, η οποία τεκµηριώνεται µε την απώλεια της έκφρασης της αποφραξίνης περίπου στο 50% των επιθηλιακών κυττάρων στο κορυφαίο τµήµα της λάχνης. Συνεπώς, το άνοιγµα της παρακυττάριας οδού φαίνεται να είναι ένας σηµαντικός παράγων στη διαφυγή ενδοτοξίνης από τον εντερικό αυλό στην πυλαία κυκλοφορία. Η ενδοτοξιναιµία, η απελευθέρωση στη συστηµατική κυκλοφορία µεσολαβητών φλεγµονής και η παρουσία οξειδωτικού stress στο έντερο πιθανώς σχετίζονται µε τη µεταβολή της έκφρασης της αποφραξίνης στον εντερικό βλεννογόνο. Επιπλέον, στον αποφρακτικό ίκτερο ανεβρέθηκε µια διαβάθµιση της έκφρασης της αποφραξίνης κατά µήκος της λάχνης, µε µεγαλύτερη απώλεια της έκφρασής της στο άνω τριτηµόριο, µικρότερη στο µέσο και ακόµα µικρότερη στην κρύπτη. Μια πιθανή εξήγηση αυτής της διαβάθµισης της απώλειας της έκφρασης της αποφραξίνης είναι ότι, δεδοµένου ότι η ανανέωση του επιθηλίου γίνεται από την κρύπτη προς την κορυφή, τα κύτταρα της κορυφής της λάχνης έχουν εκτεθεί για περισσότερο χρονικό διάστηµα στις συνθήκες οξειδωτικού stress που επικρατούν στο έντερο. Τα ρυθµιστικά εντερικά πεπτίδια, BBS και ΝΤ, δρώντας είτε άµεσα, µέσω ειδικών υποδοχέων των επιθηλιακών κυττάρων του εντέρου, είτε έµµεσα, βελτιώνοντας τη µικροκυκλοφορία του εντέρου, αποκατέστησαν την έκφραση της αποφραξίνης στον εντερικό βλεννογόνο, µείωσαν σηµαντικά την απόπτωση και το οξειδωτικό stress και ανέστρεψαν την εντερική ατροφία. Η πρόληψη, από τα ρυθµιστικά πεπτίδια, των επαγόµενων από τον αποφρακτικό ίκτερο κυτταρικών και βιοχηµικών µεταβολών του εντερικού βλεννογόνου, οδήγησε σε σηµαντική µείωση της πυλαίας και συστηµατικής ενδοτοξιναιµίας. Επιπλέον, η BBS και η ΝΤ, εξασκώντας αντιοξειδωτική δράση και στο ήπαρ, προστατεύουν από δυο µείζονες παράγοντες ηπατικής βλάβης κατά τη χολόσταση, που είναι το οξειδωτικό stress και η ενδοτοξιναιµία, οδηγώντας σε βελτίωση των ιστολογικών αλλοιώσεων της αποφρακτικής χολαγγειοπάθειας. Συµπερασµατικά, τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης δείχνουν ότι η δυσλειτουργία του εντερικού φραγµού στον αποφρακτικό ίκτερο σχετίζεται µε την επαγωγή κυτταρικών και βιοχηµικών µεταβολών στον εντερικό βλεννογόνο, οι οποίες χαρακτηρίζονται από κατά τόπους απώλεια της έκφρασης της αποφραξίνης, πρόκληση οξειδωτικού stress και επαγωγή της απόπτωσης. Τα ρυθµιστικά εντερικά πεπτίδια BBS και ΝΤ προλαµβάνοντας τις µεταβολές αυτές του εντερικού βλεννογόνου µειώνουν σηµαντικά την πυλαία και συστηµατική ενδοτοξιναιµία. Επίσης, εξασκούν προστατευτική δράση εναντίον του οξειδωτικού stress στο ήπαρ και διαφυλάσσουν την αρχιτεκτονική του πυλαίου διαστήµατος. Η συνδυασµένη ευεργετική επίδραση των ρυθµιστικών πεπτιδίων, τόσο στη δυσλειτουργία του εντερικού φραγµού και την ενδοτοξιναιµία, που ευθύνονται για την ανάπτυξη σηπτικών επιπλοκών και βλάβης αποµακρυσµένων οργάνων, όσο και στο οξειδωτικό stress και την ιστολογία του ήπατος, εισηγούνται µια νέα θεραπευτική προσέγγιση στον αποφρακτικό ίκτερο. Όπωσδήποτε απαιτούνται περαιτέρω µελέτες για τη διευκρίνιση των µηχανισµών δράσης και πιθανών παρενεργειών της BBS και της ΝΤ πριν την εφαρµογή τους στην κλινική πράξη.
Patients with obstructive jaundice, especially when exposed to the additional stress of an invasive diagnostic or therapeutic procedure, are prone to septic complications and renal dysfunction contributing to high morbidity and mortality rates. Experimental and clinical studies have shown that obstructive jaundice compromises intestinal barrier function resulting in endotoxemia, which appears to play a key role in the development of these complications. Lack of bile alters intestinal epithelial barrier function without disrupting epithelial continuity. The molecular mechanisms implicated in this phenomenon are poorly understood.
This study was undertaken to investigate the influence of experimental obstructive jaundice on the expression of the key tight junction-associated protein occludin in the intestinal epithelium, epithelial cell apoptosis and proliferation in crypts and intestinal oxidative stress. In addition, in an attempt for therapeutic intervention in obstructive jaundice, we have explored the potential positive effect of gut regulatory peptides bombesin (BBS) and neurotensin (NT) on the above-described parameters and on liver histology and oxidative stress. These factors exert a wide spectrum of actions on the gut-liver axis and they improve gastrointestinal mucosa integrity after various injurious insults.
The results of our study showed that experimental obstructive jaundice results in portal and aortic endotoxaemia. In jaundiced rats, there was total loss of occludin expression in numerous enterocytes and this effect was most profound at the upper third of the villi, while a gradient of positivity existed from crypt to tip. Intestinal cell apoptosis in crypts was significantly increased, while mitotic activity was reduced. This imbalance of cell proliferation and death in crypts was accompanied by induction of mucosal atrophy, as evidenced by morphometrical analysis and decreased DNA and protein content. Moreover, obstructive jaundice induced intestinal oxidative stress demonstrated by increased lipid peroxidation, protein oxidation, GSSG, NPSSR, PSSP and reduction of GSH. Administration of BBS or NT significantly reduced portal and systemic endotoxaemia. These agents restored occludin expression in the intestinal epithelium to the control state, significantly reduced apoptosis and oxidative stress and reversed mucosal atrophy. Moreover, both agents significantly ameliorated liver injury, as demonstrated by improvement of obstructive cholangiopathy, reduction of hepatic oxidative stress and prevention of neutrophilic accumulation in portal tracts.
Absence of intraluminal bile deprives the gut from its bacteriostatic, endotoxin-neutralizing and mucosal-trophic effect leading to increased intestinal bacterial and endotoxin load and mucosal atrophy. These alterations promote bacterial and endotoxin translocation into portal circulation and subsequently, through a decreased clearance capacity of Kupffer cells because of cholestasis, into systemic circulation. Systemic endotoxemia activates a systemic inflammatory response, which is associated with dysfunction of remote organs, while it further aggravates intestinal barrier dysfunction and cholestatic liver injury. Endotoxin and bile acids represent important sources of reactive oxygen species formation. We have demonstrated increased intestinal oxidative stress in obstructive jaundice, which possibly contributes to induction of apoptosis and inhibition of cell proliferation in intestinal crypts, leading to mucosal atrophy. Another novel finding of this study is that the intestinal paracellular barrier in jaundiced rats is disrupted, as evidenced by loss of expression of the key tight junction-associated protein occludin in approximately 50% of enterocytes at the upper third of the villi. Therefore, the opened paracellular route may significantly contribute to the escape of endotoxin from the intestinal lumen into portal circulation. Endotoxemia, systemic release of inflammatory mediators and intestinal oxidative stress are possibly associated with decreased occludin expression. A possible explanation for the gradient of occludin expression from crypt to tip is that the cells at the tip of the villi have been exposed for a longer duration to the oxidative intestinal environment of jaundiced rats since epithelial renewal takes place from crypt to tip. Gut regulatory peptides, BBS and NT, acting either directly, through specific receptors located in intestinal epithelial cells, or indirectly, through improvement of intestinal microcirculation, prevent the above-described cellular and biochemical alterations of the intestinal mucosa, leading to lower portal and systemic endotoxin concentrations. Moreover, exerting an antioxidant effect on the liver as well, they prevent two major factors in the promotion of cholestatic liver injury, oxidative stress and endotoxemia, leading to significant amelioration of obstructive cholangiopathy.
In conclusion, the results of the present study show that obstructive jaundice-induced gut barrier dysfunction is associated with regional loss of occludin expression in the intestinal epithelium, increased intestinal oxidative stress and induction of apoptosis / inhibition of proliferation in crypts leading to intestinal atrophy. Gut regulatory peptides BBS and NT exerting beneficial effects on these cellular and biochemical alterations of the intestinal mucosa prevent portal and systemic endotoxaemia. Moreover, these factors exert a protective action on portal tract architecture and hepatic oxidative stress. The combined beneficial effects of regulatory peptides on intestinal barrier dysfunction and endotoxemia, which account for septic complications and dysfunction of remote organs, and on liver oxidative status and histology, provide a novel therapeutic approach for obstructive jaundice. However, further investigation to elucidate the details of the functional mechanisms and possible side effects of BBS and NT are needed before any clinical application.
