Η μεγάλη σημασία και ο ρόλος της PEPCase στην φωτοσύνθεση και γενικότερα στην φυσιολογία φυτών φαίνεται από το ότι έχει χαρακτηριστεί από πολλούς ερευνητές ένζυμο κλειδί. Η μελέτη του έχει γίνει στόχος πολλών εργαστηρίων, όμως ο μηχανισμός της λειτουργίας του παραμένει εν μέρει ασαφής. Το ένζυμο είναι διαδεδομένο σε όλους τους φυτικούς οργανισμούς και πέρα από το κεντρικό ρόλο του στην C4 φωτοσύνθεση και στην CAM φωτοσυνθετική οδό, φαίνεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο και σε άλλες επιμέρους φυσιολογικές διαδικασίες.
Από προηγούμενη εμπειρία του εργαστηρίου μας είναι γνωστό ότι η PEPCase παρουσιάζει διαφορές στις καταλυτικές ιδιότητες της στα διάφορα είδη των C4 φυτών. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε εκχύλισμα από το φυτό σόργο Sorghum bicolor (L) Moench.
Στόχος αυτής της εργασίας είναι η μελέτη των παραμέτρων που επηρεάζουν την σταθερότητα του ενζύμου καθώς και οι καταλυτικές του ιδιότητες του. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων συνοψίζονται παρακάτω:
1. Το άριστο pΗ της ενζυμικής αντίδρασης είναι σημαντικός παράγοντας για την ρύθμιση της δραστικότητας του ενζύμου in vitro. Το άριστο pΗ της ενζυμικής αντίδρασης για τα φυτά του αγροκτήματος ήταν κοντά στο 7.0 και για τα φυτά που καλλιεργήθηκαν στα δοχεία 7,2. Παρατηρούμε επίσης ότι η ενεργότητα της PEPCase στα φύλλα από φυτά που καλλιεργήθηκαν στον ελεγχόμενο χώρο είναι πολύ χαμηλότερη εκείνης των φυτών του αγρού.
2. H δραστικότητα του ενζύμου εξαρτάται από την ηλικία των φυλλών και συνεπώς με το ύψος έκφυσης τους πάνω στο βλαστό.
3. Από την καμπύλη κορεσμού του ενζύμου (φυτά από το αγρόκτημα) ως προς το ΡΕΡ απουσία μεταβολιτών φαίνεται ότι σε pH 7,0 το ένζυμο παρουσιάζει το ένζυμο παρουσιάζει κανονική κινητική Michaelis-Menten (ορθογώνια υπερβολή) με Umax =15,38 μM CO2 min-1g-1 ν.β.φύλλων και Km = 0,36 mM.
4. Οι G6-P και Gly είναι επαγωγείς του ενζύμου PEPCase. Η G6-P αυξάνει την δραστικότητα του ενζύμου όταν η συγκέντρωση της αυξάνει από 0,5 εώς 2,0 mM, όπου παρατηρείται το μέγιστο. Όσον αφορά την επίδραση της γλυκίνης στο ένζυμο, παρατηρούμε ότι έως τα 2 mM, η επίδραση της είναι θετική στο ένζυμο, δηλαδή αυξάνει την δραστικότητα του ενώ περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωση της γλυκίνης δεν έχει καμιά επίδραση στην ενεργότητα του ενζύμου.
5. Το L-μηλικό οξύ είναι ισχυρός αναστολέας της PEPCase αφού μειώνει την δραστικότητα της PEPCase καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του, με μέγιστη επίδραση σε συγκέντρωση 5 mM.
6. Τόσο η γλυκίνη όσο η 6-φωσφορογλυκόζη, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό δεν επιδρούν σημαντικά στο Umax του ενζύμου PEPCase (από φυτά που έχουν αναπτυχθεί στον ελεγχόμενο θάλαμο). Και οι δύο μεταβολίτες όμως μείωσαν το Κm ενζύμου. Η μεγαλύτερη μείωση παρατηρήθηκε όταν επέδρασαν μαζί οι δύο μεταβολίτες. Επιπλέον παρατηρούμε ότι παρουσία και των δύο επαγωγεών, (μεμονωμένα ή συνδυαστικά) η κινητική του ενζύμου συγκλίνει περισσότερο σε κινητική Michaelis-Menten (ορθογώνια υπερβολή).
7. Η PEPCase είναι ένα φωτορυθμιζόμενο ένζυμο μέσω μίας διαδικασίας η οποία έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του Vmax του ενζύμου και την μείωση της ευαισθησίας του στο μηλικό στο ημέρας.
8. Υπάρχουν κάποιες διαφοροποιήσεις μεταξύ του ενζύμου που εκχυλίζεται από φυτά που έχουν φωτιστεί και εκείνου που εκχυλίζεται από φυτά που έχουν παραμείνει στο σκοτάδι για πολλές ώρες. Με βάση τις καμπύλες κορεσμού το ένζυμο ημέρας εμφανίζει μεγαλύτερο Umax και στις τρείς περιπτώσεις. Το ένζυμο νύχτας φαίνεται περισσότερο ευαίσθητο στην επίδραση του μηλικού από το ένζυμο της ημέρας. Όσον αφορά το Km παρατηρούμε ότι στην καμπύλη κορεσμού απουσία μεταβολιτών (control) το Km είναι μικρότερο στο ένζυμο ημέρας ενώ στην καμπύλη κορεσμού παρουσία G6-P, το Km είναι παρόμοιο και στα δύο ένζυμα. Από την καμπύλη κορεσμού παρουσία μηλικού, παρατηρούμε ότι το Km επηρεάστηκε (αυξήθηκε) περισσότερο στο ένζυμο ημέρας.
9. Η ολική δραστηριότητα του ενζύμου που εκχυλίζεται κάθε φορά παρουσιάζει μεγάλες διακυμάνσεις που προφανώς οφείλονται σε διάφορους παράγοντες όπως οι συνθήκες εκχύλισης του ενζύμου και η συμπεριφορά του σε αραιά διαλύματα. Αυτό πιθανόν να είναι και το αίτιο της ψεύδοσιγμοειδικοτητας που παρουσιάζουν οι καμπύλες κορεσμού του ενζύμου (ειδικά με την επίδραση του μηλικού).
PEPCase has been characterised as a key-enzyme because of its important role in photosynthesis and generally in plant physiology. It has been the subject of study of many laboratories but until now the properties and its biochemical operations are unclean. This enzyme exists in all plants and plays a central role in C4 and CAM photosynthesis. From our laboratory previous experience, it is known that PEPCase shows different properties and regulation among C4 plants.
In the present study, leaves from Sorghum bicolor (L) Moench were used for the isolation of the enzyme and the experiment plants were grown in University farm and a shadehouse with balanced conditions.
The aim of this thesis was the study of PEPCase enzyme properties and catalytic behaviour. The conclusions are presented below:
1. The optimum pH of the enzyme reaction is a very impotant factor of enzyme activity and was 7,0 for the enzyme extracted from plants cultivated in farm and 7,2 for the enzyme extracted from plants grown in the shadehouse.
2. The enzymic activity is affected by leave height on the plant and thus the age of the leaves.
3. The enzyme seems to follow Michaelis-Menten kinetics in vitro with Vmax= 15,38 μM CO2 min-1g-1 of wet weight of leaves and Km= 0,36 mM.
4. G6-P and Gly stimulate the enzyme at low concentrations near to 2 mM.
5. L-malate is a strong inhibitor of the enzyme with maximum inhibition at 5 mM.
6. G6-P and Gly, separately or together, do not affect the Vmax of the enzyme but decrease its Km. The presence of these metabolites in the solution of the reaction, does not affect enzyme kinetics, which appears more as Michaelis-Menten kinetics than sigmoidical kinetics.
7. PEPCase activity is light-dependent and exerted by post-translational regulation. The effect of this mechanism is that the light-enzyme is more activated and less malate sensitive by dark-enzyme.
8. There are differencies between the enzyme extracted from light-induced plants and the enzyme extracted from plants remained in dark for several hours. Light-enzyme has higher Vmax and lower Km than the dark-enzyme. L-malate affects more the dark-enzyme.
9. Enzyme activity varries possibly because of the enzyme extraction and experiment conditions and in less concentrated solutions.
