TheRasp21proto-‐oncogenes(H-‐Ras,K-‐RasandN-‐Ras)areapartofintracellularsignallingpathwaysthatplayanimportantroleincellgrowth,regulationandmalignanttransformation.Inthisstudyweinvestigatedthepresenceofmutationsatcodon12ofH-‐,K-‐andN-‐Rasoncogenesinaseriesof32benignandmalignantthyroidtumoursmatchedwithnormaladjacenttissue,usingaPCR-‐RFLPtechnique.Additionally,wemeasuredtheexpressionlevelsofthethreeRasgenesusingaquantitativeReal-‐TimePolymeraseChainReaction(qRT-‐PCR)assaywithSYBR®GreenIchemistry.Beta-‐actinservedasinternalcontrol.NoH-‐Rasmutationsweredetectedinourseriesofthyroidsamples.Additionally,N-‐Raswasmutatedinonly1/32(3.1%)malignantspecimen.Onthecontrary,K-‐Rasmutationsweredetectedin10/32(31.3%)tumorsamples.ExpressionanalysisshowedthatK-‐Raswasderegulatedin50%ofthyroidtumors,exhibitingoverexpressionin9/32(28.1%)anddownregulationin7/32(21.9%)samples,respectively.AsimilarpatternwasobservedforN-‐Rasexpression,sincein9/32(28.1%)samplesitsmRNAlevelswereelevatedandin10/32(31.3%)werereduced.Interestingly,in11/32(34.4%)samplepairsN-‐Raswasnotexpressedinneithertheneoplasticnorthenormalspecimen.Onthecontrary,H-‐RasmRNAlevelsweredownregulatedin12/32(37.5%)andelevatedin5/32(15.6%)samples,respectively.FromtheaboveresultswededucethatonlyK-‐RasmutationsareafrequenteventinthyroidmalignanciesandthatallthreeRasoncogenesdeviatefromthenormalexpressionpattern,suggestinganimportantroleforthisgenefamilyinthyroidtumorigenesis.B-‐Raf,amemberoftheRafserine/threoninekinasefamily,isanintermediatemoleculeinthemitogen-‐activatedprotein(MAP)kinasepathway,whichrelaysextracellularsignalsfromthecellmembranetothenucleusviaacascadeofphosphorylationevents,ultimatelypromotingcancerdevelopment.Thispathwayisusuallyactivatedinhumanneoplasias.ThepurposeofthisstudywastoinvestigatetheroleofB-‐Rafinthyroidpathology.Wescannedforthepresenceofmutationsatcodon600(VèE)oftheB-‐Rafgene,usingaPCRRFLPassay.Intumorswithnomutation(32benignandmalignantthyroidtumors)andintheiradjacentnormaltissue,wemeasuredtheexpressionlevelsofB-‐Rafgene,usingaquantitativeReal-‐TimePCR(qPCR)assay.B-‐RafexpressioninV600E-‐negativetumorsdeviatedfromthenormalpattern,sinceitwasoverexpressedin42%ofbenignsamplesanddownregulatedin54%ofmalignantspecimens.Hashimoto’sthyroiditisalsoseemedtoplayanimportantrole,sincebenignspecimenswithHashimoto’sthyroiditishada2.2-‐foldhigherB-‐Rafexpressionthansamples withoutthyroiditis(1.71±0.63vs.0.78±0.13).StatisticalanalysisrevealedthatB-‐Rafderegulationpostponeddiseaseonsetbymorethan10yearsinbothbenignandmalignantthyroid.(benign:55.6±3.9vs.45.3±3.3,p=0.049;malignant:52.2±3.5vs.33.0±7.9,p=0.020).Fromtheaboveresultswededucethatintheabsenceofmutationactivation,B-‐Rafoverexpressionordownregulationisaprotectiveevent,sinceitdelaysthedevelopmentofbothmalignantandbenignthyroidtumors.
ΤαRasπρωτο-‐ογκογονίδια(H-‐Ras,Κ-‐RasκαιΝ-‐Ras)είναιμέροςτωνενδοκυτταρικώνσηματοδοτικώνμονοπατιώνπουπαίζουνσημαντικόρόλοστηνκυτταρικήανάπτυξη,τηρύθμισηκαιτονκακοήθημετασχηματισμό.Σεαυτήτημελέτηερευνήθηκεηπαρουσίαμεταλλάξεωνστοκωδικόνιο12τωνΗ-‐,Κ-‐καιΝ-‐Rasογκογονιδίωνσεμιασειράαπό32καλοηθώνκαικακοηθώνόγκωντουθυρεοειδούς,συνδυαζόμεναμεφυσιολογικόγειτονικόιστό,μετηχρήσητηςαλυσιδωτήςαντίδρασηςτηςπολυμεράσηςPCRκαιτηςανάλυσηςπολυμορφισμούμεγέθουςπεριοριστικώνθραυσμάτωνRFLP.Επιπροσθέτως,μετρήσαμεταεπίπεδαέκφρασηςτωντριώνγονιδίωνRasχρησιμοποιώνταςποσοτικήαλυσιδωτήαντίδρασητηςπολυμεράσης(qPCR)μεSYBRGreenΙ®χημεία.Ηβ-‐ακτίνηχρησιμοποιήθηκεωςγονίδιοελέγχου.ΔενανιχνεύθηκανH-‐Rasμεταλλάξειςστησειράτωνδειγμάτωντουθυρεοειδούς.Επιπροσθέτως,τοΝ-‐Rasμεταλλάχθηκεσεμόνο1/32(3,1%)κακοήθηδείγμα.Αντιθέτως,Κ-‐Rasμεταλλάξειςανιχνεύθηκανσε10/32(40,6%)δείγματαόγκων.ΗανάλυσητηςέκφρασηςέδειξεότιηK-‐Rasήταναπορυθμισμένηστο50%τωνόγκωντουθυρεοειδούς,πουπαρουσιάζειυπερέκφρασησε9/32(28,1%)καιυποέκφρασησε7/32(21,9%)δείγματα,αντίστοιχα.ΈναπαρόμοιομοτίβοπαρατηρήθηκεγιαταεπίπεδαέκφρασηςτουγονιδίουΝ-‐Ras,αφούσε9/32(28,1%)δείγματαταεπίπεδατουmRNAήταναυξημένακαισε10/32(31,3%)ταεπίπεδατηςέκφρασηςήτανμειωμένα.Ενδιαφέρονείναι,ότισε11/32(34,4%)ζεύγηδειγμάτωντογονίδιοΝ-‐Rasδενεκφράζεταιούτεστηννεοπλαστικήούτεστοδείγμαφυσιολογικού.Αντιθέτως,ταmRNAεπίπεδατουγονιδίουH-‐Rasυποεκφράζεταισε12/32(37,5%)καιβρέθηκαναυξημένασε5/32(15,6%)δείγματα,αντίστοιχα.ΑπόταπαραπάνωαποτελέσματασυμπεραίνουμεότιμόνοΚ-‐RasμεταλλάξειςείναιένασυχνόσυμβάνσεκακοήθειεςτουθυρεοειδούςκαιότικαιοιτρειςογκογονίδιαRasαποκλίνουναπότοφυσιολογικόπρότυποέκφρασης,υποδηλώνονταςένασημαντικόρόλογιααυτήτηνοικογένειαγονιδίωνστηνογκογένεσητουθυρεοειδούς.ΤογονίδιοΒ-‐Raf,είναιμέλοςτηςοικογένειαςRafκινασώνσερίνης/θρεονίνης,είναιέναενδιάμεσομόριοστηνμιτογόνο-‐ενεργοποιημένηπρωτεΐνη(ΜΑΡ)κινάσηςτουμονοπατιού,πουεπάγειεξωκυτταρικάσήματααπότηνκυτταρικήμεμβράνηπροςτονπυρήναμέσωενόςκαταρράκτηγεγονότωνφωσφορυλίωσης,μεστόχοτηνπροώθησητηςανάπτυξηςτουκαρκίνου.Αυτήηοδόςσυνήθωςενεργοποιείταισεανθρώπινεςνεοπλασιές.ΟσκοπόςαυτήςτηςμελέτηςήτανναδιερευνηθείορόλοςτουΒ-‐Rafστηνπαθολογίατουθυρεοειδή.Ελέγξαμεγιατηνπαρουσίατωνμεταλλάξεωνστοκωδικόνιο600(VE)τουB-‐Raf,χρησιμοποιώνταςτηναλυσιδωτήαντίδρασητηςπολυμεράσηςPCRκαιτηνανάλυσηπολυμορφισμούμεγέθουςπεριοριστικώνθραυσμάτωνRFLP.Σε όγκουςχωρίςμετάλλαξη(32καλοήθειςκαικακοήθειςόγκοιτουθυρεοειδούς)καισεγειτονικόφυσιολογικόιστότους,μετρήθηκανταεπίπεδαέκφρασηςτουΒ-‐Rafγονιδίου,χρησιμοποιώνταςποσοτικήPCRπραγματικούχρόνου(qPCR).ΗΒ-‐RafV600Eέκφρασησε-‐αρνητικούςόγκουςπαρέκκλινεαπότοφυσιολογικόπρότυπο,δεδομένουότιυπερεκφράζεταιστο42%τωνκαλοήθωνδειγμάτωνκαιυποεκφράζεταιστο54%τωνκακοήθωνδειγμάτων.ΗθυρεοειδίτιδαHashimotoεπίσηςφάνηκεναπαίζειένασημαντικόρόλο,δεδομένουότιτακαλοήθηδείγματαμεθυρεοειδίτιδαHashimotoείχαν2,2φορέςυψηλότερηΒ-‐Rafέκφρασηςαπόταδείγματαχωρίςθυρεοειδίτιδα(1,71±0,63έναντι0,78±0,13).ΗστατιστικήανάλυσηαποκάλυψεότιηΒ-‐Rafαπορρύθμισηαναβάλλειτηνεκδήλωσητηςνόσουκατάπερισσότεροαπό10χρόνιασεκαλοήθειςκαικακοήθειςόγκουςτουθυρεοειδούς.(καλοήθης:55,6±3,9έναντι45,3±3,3,p=0,049?κακοήθεις:52,2±3,5έναντι33,0±7,9,p=0,020).Απόταπαραπάνωαποτελέσματασυμπεραίνουμεότιστηναπουσίατηςενεργοποίησηςτηςμετάλλαξης,Β-‐Rafυπερέκφρασηήυποέκφρασηείναιέναπροστατευτικόγεγονός,δεδομένουότικαθυστερείτηνανάπτυξητόσοτωνκακοήθωνκαικαλοήθωνόγκωντουθυρεοειδούς.
National Documentation Centre (EKT)
