WPBs are endothelial cell-specific secretory organelles. They carry a variety of bioactive molecules with important roles in the maintenance of vascular tone, in thrombosis, inflammation and angiogenesis. Members of the Rab family of proteins are the responsible molecules for the transport and fusion of granules with their target-membrane. Rabs possess a complex role, controlling granule biogenesis, their transport and docking to the plasma membrane, as well as the fusion reaction. They mediate their functions through interactions with effector molecules. So far, two members of this family, Rab27a και Rab3d, are known to localize on WPB membrane. They are both known to inhibit WPB secretion. In order to study the molecular mechanism through which WPB secretion is achieved, we aimed first to find the whole spectrum of Rabs which localize on these organelles. We performed, thus, a screening of all known Rabs, Rab1 to 43, each one GFP tagged, in HUVEC, and found five members of this family decorating WPB membrane. These were Rab27, Rab3, Rab15, Rab33 and Rab37. To study their role in vWF secretion we knocked them down and we observed that Rab27, Rab3 and Rab15 are necessary for vWF regulated secretion, while Rab33 and Rab37 are not. Finally, in order to study if Rab27, Rab3 and Rab15 cooperate in the secretory process of WPB release, we knocked them down simultaneously, in all possible combinations. We concluded that Rab27 and Rab3 act in a linear manner in the regulatory pathway of WPB secretion, while simultaneous knockdown of Rab27 and Rab15 resulted in a much more significant reduction of WPB secretion than did the knocking down of each one of these proteins alone. In order to study the mechanism through which Rab27 mediates its function on WPB secretion, we performed a yeast-two hybrid screening, using hRab27aQ78L as a bait and a cDNA library of human placenta as a prey, and we identified Munc13-4 as the most reliable interactor. Immunoblotting, immunofluorescence and knocking down experiments showed that Munc13-4 is expressed in HUVEC, localizes on WPBs and is necessary for their regulated secretion. Immunoprecipitation experiments showed that Munc13-4 interacts, apart from Rab27, as well as with Rab15, providing the possible mechanism of the additive function of Rab27a and Rab15 on WPB secretion. Rab15 and Munc13-4 colocalize on WPB-like structures in HUVEC.
Τα WPBs είναι εξειδικευμένα εκκριτικά οργανίδια, αποκλειστικά των ενδοθηλιακών κυττάρων. Περιέχουν ένα πλήθος μορίων-φορτίων, τα οποία διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση του αγγειακού τόνου, τη θρόμβωση, τη φλεγμονή και την αγγειογένεση. Σημαντικά μόρια για τη σύντηξη των κυστιδίων με τη μεμβράνη στόχο είναι τα μέλη της οικογένειας των Rabs. Οι πρωτεΐνες αυτές ελέγχουν τη δημιουργία του κυστιδίου, τη μετακίνησή του και τον ελλιμενισμό του στη μεμβράνη-στόχο. Οι δράσεις αυτές των Rabs επιτελούνται μέσω αλληλεπίδρασης με πρωτεΐνες-τελεστές. Μέχρι σήμερα, δύο μέλη της οικογένειας των Rabs, οι Rab27a και Rab3d, έχουν βρεθεί να εντοπίζονται στη μεμβράνη των WPBs. Και οι δύο αυτές Rabs αναστέλλουν την έκκριση των WPBs. Προκειμένου να κατανοήσουμε το μοριακό μηχανισμό, μέσω του οποίου επιτυγχάνεται η έκκριση, πραγματοποιήσαμε μεθοδολογία σάρωσης όλων των Rab GTPασών του ανθρώπινου γονιδιώματος, Rab1 έως Rab43. Πέντε μέλη της οικογένειας των Rabs ανιχνεύτηκαν στα WPBs. Πρόκειται για τις Rab27, Rab3, Rab15, Rab33 και Rab37. Για να μελετήσουμε το ρόλο τους στην έκκριση των WPBs, αποσιωπήσαμε με εξειδικευμένα siRNA ολιγονουκλεοτίδια μία προς μία τις πρωτεΐνες αυτές και παρατηρήσαμε πως οι Rab27, Rab3 και Rab15 είναι απαραίτητες για την έκκριση των WPBs, ενώ οι Rab33 και Rab37 δε φάνηκε να την επηρεάζουν σημαντικά. Επιπλέον, με πειράματα ταυτόχρονης αποσιώπησης καταλήξαμε στο συμπέρασμα πως οι Rab27 και Rab3 δρουν στο ίδιο μονοπάτι ρύθμισης της έκκρισης των WPBs και μάλιστα διαδοχικά, ενώ οι Rab27 και Rab15 παρουσιάζουν αθροιστική δράση στη ρύθμιση της έκκρισης. Προκειμένου να μελετήσουμε το μηχανισμό, μέσω του οποίου η Rab27a ρυθμίζει την έκκριση των WPBs, πραγματοποιήσαμε σάρωση διπλού υβριδίου σε κύτταρα ζύμης, χρησιμοποιώντας ως δόλωμα τη Rab27aQ78L και ως θήραμα τα cDNA της βιβλιοθήκης από ανθρώπινο πλακούντα. Η μόνη αξιόπιστη αλληλεπίδραση που προέκυψε ήταν με τη Munc13-4. Πειράματα ανοσοαποτύπωσης, ανοσοφθορισμού και αποσιώπησης απέδειξαν πως η πρωτεΐνη αυτή εκφράζεται στα κύτταρα HUVE, εντοπίζεται στα WPBs και είναι απαραίτητη για την έκκρισή τους. Πειράματα ανοσοκαταβύθισης έδειξαν πως η Munc13-4 αλληλεπιδρά, εκτός από τη Rab27, και με τη Rab15, παρέχοντας δυνητικά τη μηχανιστική βάση της αθροιστικής επίδρασης που έχει η ταυτόχρονη αποσιώπηση των Rab27 και Rab15 στην έκκριση των WPBs. Οι δύο αυτές πρωτεΐνες, Munc13-4 και Rab15, στα κύτταρα HUVE, συνεντοπίζονται σε οργανίδια που φέρουν το χαρακτηριστικό σχήμα των WPBs.
