Κατά την ανακάλυψή της το 1994 από τον Ζhang και τους συνεργάτες του, η λεπτίνη, το πρωτεϊνικό προϊόν του ob γονιδίου, συσχετίστηκε αποκλειστικά με τη ρύθμιση του μεταβολισμού και του ενεργειακού ισοζυγίου του οργανισμού, πράγμα που προδίδει και η ετυμολογία του όρου. Πέραν της κεντρικής δράσης της όμως, με την πάροδο των ετών αποδείχτηκε πως έχει ένα ευρύτατο φάσμα ρυθμιστικών ρόλων με πολλούς ιστούς αποδέκτες μιας και έχει διαπιστωθεί η συμμετοχή της στην ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων και την αγγειογένεση, στην ενεργοποίηση του συμπαθητικού συστήματος, στην οξείδωση των ελεύθερων λιπαρών οξέων στους σκελετικούς μύες, στην ανάπτυξη και αναμόρφωση των οστών, στην αναπαραγωγή, στην αιμοποίηση, καθώς και στην ανοσολογική απόκριση και φλεγμονή.Τα τελευταία χρόνια η επιστημονική έρευνα έχει αναδείξει τον ανοσορυθμιστικό ρόλο της λεπτίνης ως σημαντικό μηχανισμό που ενέχεται στις διαδικασίες ίνωσης του ήπατος, καθώς και της συντήρησης της χρόνιας φλεγμονής σε αυτό. Πέραν τούτου ισχυροποιείται η συσχέτιση που φαίνεται να έχει η παχυσαρκία και συνεπώς οι κυτταροκίνες του λιπώδους ιστού, μεταξύ αυτών και η λεπτίνη, με τους μηχανισμούς ογκογένεσης σε πολλούς ιστούς του ανθρώπινου σώματος, όπως ο μαστός, το παχύ έντερο, ο προστάτης, το ενδομήτριο, η ωοθήκη, το ήπαρ κ.α.Οι ισχυρές βιβλιογραφικές ενδείξεις για τον πολυσχιδή ρόλο της λεπτίνης μας ώθησαν στην αναζήτηση στοιχείων που πιστοποιούν τον ανοσορυθμιστικό και καρκινογενετικό ρόλο της στις χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες και την αποσαφήνιση των μοριακών εκείνων μηχανισμών που διεκπεραιώνουν τις δράσεις της στο ήπαρ. Κομβικό σημείο της παρούσας έρευνας αποτέλεσε η στοιχειοθέτηση της καταλυτικής υπομονάδας του ενζύμου της τελομεράσης (hTERT) ως στόχου της λεπτίνης στον ηπατικό ιστό.Ειδικότερα παρατηρήσαμε, σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης, σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης των OB-Rl και OB-Rs στα περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος ασθενών με HBV και HCV λοίμωξη συγκριτικά με τους υγιείς και τους ασθενείς με μη ιογενούς αιτιολογίας ηπατοπάθεια. Η παρατηρούμενη αυτή μείωση της επιφανειακής πρωτεΐνης του OB-R στα δείγματα των ασθενών με HBV, HCV λοίμωξη θα μπορούσε να αντικατοπτρίζει μια επαγόμενη από τους ιούς μοριακή δυσλειτουργία ή αυξημένη ευαισθησία στις διαδικασίες απόπτωσης των PBMCs, που ως τελικό αποτέλεσμα θα έχει την μείωση ή την πλήρη καταστολή της μετάφρασης. Προτείνουμε τη συμμετοχή των OB-Rl, OB-Rs στην ανοσολογική δυσλειτουργία που παρατηρείται στους ασθενείς με χρόνιες HBV, HCV λοιμώξεις, αφού μειωμένη έκφραση των υποδοχέων στην κυτταρική επιφάνεια των περιφερικών μονοπύρηνων κυττάρων του αίματος αφαιρεί από τη λεπτίνη την δυνατότητα διέγερσης των PBMCs, μειώνει τον αριθμό τον ανοσολογικών κυττάρων και πιθανά αυξάνει το κλάσμα των ανοσοκυττάρων που περιέρχονται σε φάση απόπτωσης.Ένα ακόμα εύρημα του πρώτου κύκλου της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η θετική συσχέτιση στην έκφραση μεταξύ του OB-Rl και OB-Rs (ο OB-Rs εκφράζεται σταθερά σε περίπου διπλάσιο ποσό σε σχέση με τον OB-Rl) στο σύνολο των δειγμάτων της μελέτης που αφορούσε στα PBMCs. Πρόκειται για ένα στοιχείο που αναδεικνύει ένα σταθερό και παράλληλο πρότυπο έκφρασης των δύο υποδοχέων και πιθανά αποτελεί ένδειξη ότι ο λιγότερο λειτουργικός OB-Rs ευοδώνει τη δράση του λειτουργικού OB-Rl ή ρυθμίζει τα επίπεδα της κυκλοφορούσας στον ορό λεπτίνης ή συμβάλλει στη μεταφορά της λεπτίνης σε ενδοκυττάρια διαμερίσματα. Η υψηλή θετική συσχέτιση του OB-Rs με την ηλικία στο σύνολο των δειγμάτων μας κατευθύνει υπέρ της ισχυρής εξάρτησης που μπορεί να υπάρχει μεταξύ της ικανότητας ανοσολογικής απόκρισης του οργανισμού και της ηλικίας.Επίσης, ανιχνεύσαμε έκφραση του mRNA της λεπτίνης στα PBMCs μικρού αριθμού δειγμάτων από την ομάδα με HCV λοίμωξη και μεγάλου αριθμού από τα δείγματα των ασθενών με μη ιογενείς ηπατοπάθειες. Η αύξηση αυτή της έκφρασης της λεπτίνης συνδυαζόμενη με την αύξηση της έκφρασης των υποδοχέων της, σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης, στους ασθενείς με μη ιογενούς αιτιολογίας ηπατοπάθειες υποστηρίζει την ύπαρξη ενός μηχανισμού αυτοκρινούς ανατροφοδότησης που εκπορεύεται από τη λεπτίνη στα PBMCs. Αυτός ο μηχανισμός εξηγεί επίσης και την ανοσοδιέγερση, απόρροια της οποίας είναι η ηπατική κυτταροτοξικότητα, που παρατηρείται στην αυτοάνοση και αλκοολική ηπατίτιδα. Σε ό,τι αφορά στα επίπεδα της λεπτίνης του ορού των ασθενών με χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες υπάρχουν αντικρουόμενα ευρήματα στη διεθνή βιβλιογραφία. Τα ευρήματα της παρούσας διατριβής υποστηρίζουν ότι τα επίπεδα της λεπτίνης του ορού των ασθενών με ιογενείς ηπατίτιδες (B και C) ή ηπατική κίρρωση είναι χαμηλότερα σε σχέση με αυτά των υγειών. Επιχειρώντας να ερμηνεύσουμε τα αποτελέσματά μας οδηγηθήκαμε στο συμπέρασμα ότι η μείωση της έκκρισης της λεπτίνης από το λιπώδη ιστό αποτελεί μέρος ενός μηχανισμού ανατροφοδότησης που επιχειρεί να απαντήσει στο αρνητικό ενεργειακό ισοζύγιο που χαρακτηρίζει την πορεία των χρόνιων ιογενών ηπατοπαθειών. Επειδή οι χρόνιες ηπατοπάθειες προσφέρουν ένα περιβάλλον μιτογόνο αλλά και μεταλλαξιγόνο, το οποίο είναι σε θέση να αλληλεπιδράσει και να διαφοροποιήσει το επίπεδο έκφρασης των γονιδίων στο ηπατοκύτταρο αποφασίσαμε να υπερσκελίσουμε την κεντρικώς παραγόμενη λεπτίνη και να εστιάσουμε στην τοπική έκφρασή της στο μικροπεριβάλλον του ήπατος. Παρατηρήσαμε ότι τόσο η παραγωγή της λεπτίνης όσο και η έκφραση των υποδοχέων της (OB-Rl, OB-Rs) έβαιναν αυξανόμενες κατά τη μετάπτωση από το υγιές ήπαρ αρχικά σε φλεγμαίνον, υπό το καθεστώς χρόνιας ιογενούς ηπατίτιδας, και τελικά σε ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Φαίνεται ότι η λεπτίνη όχι μόνο ευνοεί τις διαδικασίες ίνωσης και φλεγμονής, αλλά συμβάλλει αποφασιστικά στην εγκαθίδρυση ενός μεταλλαξιγόνου περιβάλλοντος στο ήπαρ ασθενών με HBV και HCV λοίμωξη.Το γεγονός όμως ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης της λεπτίνης και των υποδοχέων της σε ηπατικό ιστό από ΗΚΚ δε διαπιστώσαμε να συσχετίζονται με το ΒΜΙ των ασθενών, μας οδήγησε στην υπόθεση ότι η παραγωγή λεπτίνης στο ήπαρ αυτών των ασθενών δε ρυθμίζεται απευθείας από τα αποθέματα λίπους του οργανισμού, αλλά αντικατοπτρίζει και καθορίζεται από τις μοριακές αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα στο ογκογενετικό μικροπεριβάλλον του ήπατος. Μπορεί, λοιπόν, η κυκλοφορούσα λεπτίνη, το ποσό της οποίας καθορίζεται από το ΒΜΙ, να ευοδώνει τη φλεγμονώδη διήθηση και ίνωση του ήπατος κατά τις χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες, αλλά κομβικό σημείο που προάγει τη μεταλλαξιγόνο διαδικασία και καθορίζει την εδραίωση του ΗΚΚ φαίνεται να είναι η τοπική παραγωγή λεπτίνης στο ηπαποκύτταρο.Στον άνθρωπο η γένεση του ΗΚΚ είναι αποτέλεσμα μιας πολυπαραγοντικής διαδικασίας που περιλαμβάνει γενετικές και επιγενετικές τροποποιήσεις οι οποίες λαμβάνουν χώρα σε πληθώρα γονιδίων στα ηπατοκύτταρα. Μεταξύ των παραπάνω γονιδίων είναι και το γονίδιο που κωδικοποιεί τη σύνθεση της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης (hTERT), το οποίο μάλιστα είναι το μόνο εξ αυτών που παρουσιάζει μηδενική έκφραση στα φυσιολογικά ηπατοκύτταρα. Ο ρόλος της τελομεράσης στις χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες και στη μετεξέλιξή τους σε κακοήθεια, καθώς και η διαφαινόμενη θέση του συστήματος της λεπτίνης στη φλεγμονή του ήπατος και το ΗΚΚ, μας ώθησαν στην αναζήτηση της πιθανής συσχέτισης μεταξύ τους σε μοριακό επίπεδο, όπως και του μηχανισμού αλληλεπίδρασης τους εντός του ηπατικού παρεγχύματος. Σε αυτή την κατεύθυνση ενδιαφέρον εύρημά μας υπήρξε η υψηλή συσχέτιση της λεπτίνης τόσο με την hTERT όσο και με την δραστικότητα της τελομεράσης μόνο στα δείγματα ηπατικού ιστού με ΗΚΚ. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η λεπτίνη ήταν ικανή για απευθείας θετική επίδραση στην έκφραση του mRNA της hTERT και τη δραστικότητα της τελομεράσης στα HepG2 κύτταρα.Η αρχική μας διαπίστωση ότι η λεπτίνη αποτελεί ρυθμιστή της έκφρασης της hTERT και στον ηπατικό ιστό, μας ώθησε στο να εμβαθύνουμε σε ό,τι αφορά στο μοριακό μηχανισμό ενδοκυττάριας μεταγωγής σήματος που κινητοποιείται από τη λεπτίνη και ενεργοποιεί ή αναστέλλει τη γονιδιακή έκφραση της hTERT. Ο υποκινητής της hTERT περιέχει πληθώρα περιοχών πρόσδεσης για μεταγραφικούς παράγοντες μεταξύ των οποίων είναι διάφοροι ενεργοποιητές, όπως οι c-myc, Sp1 και STAT3 και καταστολείς, όπως οι mad1 και p53 που καθορίζουν την έκφρασή της σε μεταγραφικό επίπεδο.Συνυπολογίζοντας τα ανωτέρω, εφαρμόσαμε τη μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης της χρωματίνης ώστε να ερευνήσουμε το κατά πόσο η λεπτίνη ευοδώνει την πρόσδεση του STAT3 στον υποκινητή της hTERT και στα HepG2 κύτταρα. Βρήκαμε ότι η χορήγηση λεπτίνης, βραχυπρόθεσμα ή μακροχρόνια, αυξάνει την πρόσδεση του STAT3 σε δύο θέσεις του υποκινητή της hTERT. Αυτό μας το εύρημα αποσαφηνίζει ότι ο άξονας λεπτίνη-υποδοχέας λεπτίνης-STAT3-hTERT έχει ρόλο στις διαδικασίες εγκαθίδρυσης και εδραίωσης της καρκινικής μεταλλαγής στο ηπατοκύτταρο.. Το αυξανόμενο ενδιαφέρον και οι ισχυρές ενδείξεις για το σημαντικό ρόλο διάφορων γενετικών και επιγενετικών μηχανισμών ρύθμισης της έκφρασης της hTERT στα κύτταρα, μας οδήγησαν σε πιο ενδελεχή έλεγχο και αξιολόγηση του βαθμού πρόσδεσης των Myc, Max, Mad και της ακετυλιωμένης Η3 ιστόνης στον υποκινητή της hTERT μετά τη χορήγηση λεπτίνης. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή δείξαμε για πρώτη φορά υψηλή συσχέτιση της μετάπτωσης από το Mad1/Max πρότυπο πρόσδεσης σε Myc/Max πρότυπο με την ενεργοποίηση της μεταγραφής του hTERT γονιδίου μετά τη χορήγηση λεπτίνης στα HepG2 κύτταρα. Επιπλέον μετά από μακροχρόνια χορήγηση λεπτίνης για διάστημα 2 μηνών διαπιστώσαμε ακόμα μεγαλύτερα επίπεδα πρόσδεσης του Myc/Max συμπλόκου στον υποκινητή του hTERT, τα οποία αυτή τη φορά συνοδεύονταν από αύξηση της ακετυλίωσης της ιστόνης Η3. Εφόσον όμως η μακροχρόνια χορήγηση λεπτίνης δεν πέτυχε να αυξήσει τα επίπεδα mRNA της hTERT ούτε την ΤΑ υποθέτουμε ότι η λεπτινοεξαρτημένη υπερέκφραση της hTERT βρίσκεται υπό ένα διαρκή έλεγχο από διάφορους μετα-μεταγραφικούς μοριακούς ρυθμιστές. Καταλήξαμε επίσης στο συμπέρασμα ότι η αλληλουχία δράσης των διάφορων μεταγραφικών παραγόντων και επιγενετικών μηχανισμών έχει ισχυρή εξάρτηση από το χρόνο δράσης της λεπτίνης στο ηπατοκύτταρο.Καθώς η λεπτινο-εξαρτημένη υπερέκφραση της hTERT μπορεί να οδηγήσει σε ογκογόνο ανάπτυξη και απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου ερευνήσαμε στη συνέχεια την επίδραση της λεπτίνης στον πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα των HepG2 κυττάρων. Λεπτομερέστερα, η λεπτίνη διέγειρε την ανάπτυξη των HepG2 κυττάρων σύμφωνα με ένα χρόνο- και δόσο-εξαρτημένο πρότυπο.Τα τελευταία χρόνια ισχυροποιούνται συνεχώς οι ενδείξεις ότι η φλεγμονή αποτελεί σημαντική προϋπόθεση για την έναρξη, εγκατάσταση και πρόοδο των όγκων στο ήπαρ. Ο πιθανός ρόλος των φλεγμονωδών κυτταροκινών στην ανάπτυξη και εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων μας οδήγησε στη μελέτη της επίδρασης της λεπτίνης στην παραγωγή IL-1, IL-6 και TGF-β1 από τα ανθρώπινα ηπατοκαρκινικά κύτταρα. Σε αυτό τον κύκλο πειραμάτων βρέθηκε ότι η χορήγηση λεπτίνης σε HepG2 κύτταρα αύξησε την παραγωγή της IL-6 και κατέστειλε την παραγωγή του TGF-β1 με ένα χρόνο- και δόσο-εξαρτημένο πρότυπο, ενώ αντίθετα δεν επηρέασε καθόλου τις IL-1a και IL-1β. Προτείνεται έτσι μια επιπλέον εναλλακτική οδός επιρροής της λεπτίνης επί της hTERT που δεν περιλαμβάνει την διαμεσολάβηση του OB-R και του JAK/STAT3 μοριακού μονοπατιού, αλλά της IL-6 και του μοριακού μονοπατιού PI3K/AKT.Παρατηρήσαμε επίσης ότι η λεπτίνη ήταν ικανή να καταστείλει την έκφραση της MMP-1 και να διεγείρει περαιτέρω την έκφραση των MMP-9 και -13, ενώ η χρήση siRNA για την λεπτίνη είχε ακριβώς τα αντίθετα αποτελέσματα, πράγμα που την καθιστά ρυθμιστή της δημιουργίας ενός μικροπεριβάλλοντος που ευνοεί τη διείσδυση και μετάσταση του ΗΚΚ στο κιρρωτικό ήπαρ.Έτσι, μετά από ένα κύκλο πειραμάτων που μας βοήθησαν να διακρίνουμε τους μοριακούς μηχανισμούς που επάγονται ή αναστέλλονται από την λεπτίνη στο ηπατοκαρκινικό κύτταρο, στη συνέχεια επιδιώξαμε να αποσαφηνίσουμε αν η έκφραση της λεπτίνης ελέγχεται από την πρόσδεση της ακετυλιωμένης Η3 ιστόνης στο δικό της υποκινητή. Σε αυτό μας το εγχείρημα μας βοήθησε η τριχοστατίνη Α (TSA), ένας αναστολέας της αποακετυλίωσης των ιστονών. Βρέθηκε έτσι, ότι ενώ πριν τη χορήγηση TSA στα HepG2 η πρόσδεση της ακετυλιωμένης Η3 στον υποκινητή της λεπτίνης ήταν μηδενική, μετά την προσθήκη της TSA παρατηρήθηκε ισχυρό σήμα των ανοσοκατακρημνισμάτων της. Τέλος βρέθηκε ότι η IL-6 προκαλεί αύξηση στην παραγωγή της λεπτίνης και με το ίδιο πρότυπο αύξηση και στην έκφραση του mRNA της hTERT, καθώς και στην ενεργότητα της τελομεράσης. Καθίσταται σαφής έτσι ο διαδραστικός χαρακτήρας της σχέσης μεταξύ λεπτίνης και IL-6 στο ογκογόνο μικροπεριβάλλον του ήπατος με τελική κατάληξη την ενεργοποίηση της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης. Τα ανωτέρω ευρήματα καθιστούν την hTERT γονίδιο στόχο για την λεπτίνη στα ηπατοκαρκινικά κύτταρα και ισχυροποιούν περαιτέρω τον κομβικό ρόλο του συστήματος της λεπτίνης στην μακρόχρονη και πολυσχιδή διαδικασία της ογκογένεσης στο χρονίως φλεγμαίνον ήπαρ. Επιπλέον συμβάλλουν σημαντικά στη διαλεύκανση των μοριακών εκείνων μηχανισμών που κινητοποιούν γενετικές και επιγενετικές αλληλεπιδράσεις και διαμεσολαβούν τον ανοσολογικό και καρκινογενετικό ρόλο της λεπτίνης στο μικροπεριβάλλον του ήπατος.
When leptin, the protein product of ob gene, was discovered in 1994 by Zhang and colleagues, it was exclusively associated with metabolism regulation and the organism energy balance. Beyond this central action of leptin, however, it has been proven over the years that leptin possesses a wide range of regulatory roles in many different tissues since leptin has been found to be implicated in the development of endothelial cells and angiogenesis, activation of the sympathetic nervous system, free fatty acids oxidation in the skeletal muscles, bone development and remodeling, reproduction, hematopoiesis as well as the immune response and inflammation. In the past years, scientific research has highlighted leptin’s immunoregulatory role as an important mechanism implicated in liver fibrosis and in the maintenance of chronic inflammation in the liver. Moreover, it seems that there is a strong correlation between obesity, and therefore the cytokines of the adipose tissue, such as leptin, and the mechanisms of carcinogenesis in many human tissues such as breast, colon, prostate, endometrium, ovary, liver, etc. Multiple studies focus on the multifaceted role of leptin, prompted us to investigate the validation of the immunoregulatory and carcinogenic role of leptin in chronic viral liver diseases and the decipherment of the molecular mechanisms carrying out leptin’s action in the liver. A focal point of the present research has been the characterization of the catalytic subunit of telomerase (hTERT), as a molecular target of leptin in liver tissue. More specifically, we observed lower expression levels for OB-Rl and OB-Rs mRNA and protein in peripheral blood mononuclear cells in patients with HBV and HCV infections, compared to healthy subjects and patients with non-viral liver disease. The observed reduction of the membrane OB-R protein in the samples of HBV and HCV infected patients could reflect a virus-induced molecular dysfunction, or an increased susceptibility of PBMCs to apoptosis, which will ultimately result in the reduction or complete suppression of translation. We suggest the involvement of OB-Rl, OB-Rs in the immune dysfunction observed in patients with chronic HBV, HCV infections, since decreased expression of peripheral blood mononuclear cells membrane receptors removes leptin’s possibility to stimulate PBMCs, reduces the number of immune cells and possibly increases the fraction of immune cells entering apoptosis. Another finding of the first part of the present thesis has been the positive correlation between the expression of OB-Rl and OB-Rs (OB-Rs expression is consistently two fold-increased compared to OB-Rl expression) in PBMCs in all of the samples of the study. This points to a steady and parallel expression pattern of both receptors and probably indicates that the less functional OB-Rs favors the action of the more functional OB-Rl or regulates circulating serum leptin levels or contributes to the transportation of leptin in intracellular compartments. The high correlation of OB-Rs with age in all samples tested, leads us towards the strong correlation (dependence) that could exist between the body’s immune response capacity and age. Moreover, we detected leptin mRNA expression in PBMCs in a small number of samples within the HCV infected group and in a large number of samples within the non-viral liver diseased group. This increase in leptin expression combined with the increased mRNA and protein expression of its receptors in patients with non-viral liver diseases supports the existence of an autocrine feedback mechanism stemming from leptin to PBMCs. This mechanism also gives an explanation for the immune stimulation observed in autoimmune and alcoholic hepatitis, giving rise to hepatic cytotoxicity. In terms of serum leptin levels in patients with chronic viral liver diseases, there are conflicting findings in literature. The findings of the present study suggest that serum leptin levels in patients with viral hepatitis (B and C) or liver cirrhosis are lower compared to those of healthy subjects. In order to explain our findings, we concluded that the reduction of leptin secretion from adipose tissue is part of a feedback mechanism attempting to respond to the negative energy balance characterizing the course of chronic viral liver diseases. Since chronic liver diseases provide a mitogenic and mutagenic environment, able to interact and alter gene expression levels within the hepatocyte, we decided to outweight the centrally produced leptin and focus on its local expression within the liver microenvironment. We observed that both the production of leptin and the expression of its receptors (OB-Rl, OB-Rs) were continuously increased during the transition from healthy to inflamed liver, initially on chronic viral hepatitis and finally to hepatocellular carcinoma. It seems that leptin not only promotes the processes of fibrosis and inflammation, but also contributes decisively to the establishment of a mutagenic environment in the liver of patients with HBV and HCV infections. The fact that high expression levels of leptin and its receptors in liver tissue of HCC were not found to correlate with the patients BMI, led us to the assumption that leptin production in the patients’ liver is not directly regulated by the organism fat deposits, but rather reflects and is determined by the molecular interactions taking place within the oncogenic microenvironment of the liver. It is possible, therefore, that circulating leptin, whose amount is determined by the BMI, favours inflammatory infiltration and liver fibrosis during chronic liver diseases, but the local leptin production in the hepatocyte would rather seem to promote the mutational processes and the establishment of HCC.In humans, HCC initiation is the result of a multifactorial process involving genetic and epigenetic modifications occurring in many genes in the hepatocyte. Among these genes, the gene encoding for the catalytic subunit of telomerase (hTERT), is the only one that is not expressed in normal hepatocytes. The role of telomerase in chronic viral liver diseases and their evolution into malignancy, as well as the apparent role of leptin in liver inflammation and HCC, prompted us to search for a possible correlation between them at a molecular level and also for a possible mechanism regarding their interaction within the hepatic parenchyma. In this direction, we found an interesting correlation between leptin and hTERT expression as well as telomerase activity in the HCC liver tissue samples only. Furthermore, we found that leptin was able to have a direct positive effect on hTERT mRNA expression and on telomerase activity in HepG2 cells. Our initial finding that leptin is a regulator of hTERT expression in liver tissue prompted us to further investigate the molecular mechanism of intracellular signal transduction driven by leptin and leading to the activation or inhibition of hTERT gene expression. hTERT promoter contains a multitude of binding sites for transcription factors, either activators such as c-myc, Sp1 and STAT3, or suppressors such as mad1 and p53, regulating its transcription. Taking into account the above, we used chromatin immunoprecipitation in order to investigate whether leptin favours STAT3 binding on hTERT promoter in HepG2 cells. We found that short or long term leptin administration, increases STAT3 binding on two binding sites of the hTERT promoter. This finding clarifies that the axis leptin-leptin receptor-STAT3-hTERT has a role in the processes of tumorigenic mutation initiation and establishment in the hepatocyte. The growing interest and the strong evidence concerning the important role of several genetic and epigenetic mechanisms of regulation of hTERT expression, led us to a more profound review and evaluation of the degree of Myc, Mad, Max and acetylated H3 binding on hTERT promoter after leptin administration. In the present thesis, we demonstrated, for the first time, that leptin administration in HepG2 cells led to a switch of Mad1/Max to Myc/Max binding to hTERT promoter and a subsequent activation of hTERT gene transcription. Furthermore, long-term (two month) leptin administration led to further increase of Myc/Max complex binding to hTERT promoter and a concomitant increase of the acetylation status of H3 histone. However, as long-term leptin administration did not succeed to increase hTERT mRNA levels, neither TA, we hypothesized that leptin-dependent overexpression of hTERT is under constant control by noumerous post-transcriptional regulators. We also concluded that the sequential action of several transcription factors and epigenetic mechanisms strongly depends on the time of action of leptin on the hepatocyte. As the leptin-dependent overexpression of hTERT may lead to oncogenic growth and cell cycle deregulation, we investigated leptin’s effect on HepG2 cell proliferation and viability. In detail, leptin stimulated HepG2 cell growth in a time- and dose-dependent manner. In recent years, increasing evidence suggests that inflammation is an important prerequisite for the liver tumor initiation, establishment and progress. The possible role of inflammatory cytokines in the development and spread of tumor cells, led us to the investigation of leptin effect on the production of IL-1, IL-6 and TGF-β1 by human hepatocarcinoma cells. In this series of tests, we found that leptin administration in HepG2 cells increased IL-6 production and suppressed TGF-β1 production in a time- and dose-dependent manner, while no effect was observed on IL-1a and IL-1β production. Therefore, we propose an additional alternative pathway of leptin effect on hTERT which does not include OB-R and JAK/STAT3 molecular pathway mediation, but IL-6 and the PI3K/AKT molecular pathway.We also observed that leptin was able to suppress MMP-1 expression and further stimulate MMP-9 and -13 expression, while the use of siRNA against leptin had the exact opposite effect, which establishes leptin as a regulator of a microenvironment facilitating the infiltration and metastasis of HCC in cirrhotic liver.Therefore, after a round of tests that helped us distinguish the molecular mechanisms induced or inhibited by leptin in hepatocarcinoma cells, we sought to decipher whether leptin expression is controlled by the binding of acetylated H3 histone on its own promoter. We used trichostatin A (TSA), an inhibitor of histone deacetylation and found that while no binding of acetylated H3 on leptin promoter was observed,before TSA administration in HepG2 cells, TSA caused a strong binding of acH3 on the promoter. Finally, we found thet IL-6 increases leptin production and similarly hTERT mRNA expression and telomerase activity. Therefore, the interactive nature in the relationship between leptin and IL-6 in the oncogenic microenvironment of the liver becomes clear, leading to the activation of telomerase catalytic subunit. The above findings make hTERT a target gene for leptin in hepatocellular cells and further strengthen the focal role of the leptin system in the long and multifaceted process of oncogenesis in the chronically inflamed liver. In addition, they contribute significantly to the elucidation of the molecular mechanisms that motivate genetic and epigenetic interactions and mediate the immune and carcinogenic role of leptin in the liver microenvironment.
