The nucleobase-ascorbate transporter (NAT) family is an evolutionarily broad family of nucleobase-ascorbate transporters with more than 2000 putative members based on genome programs from all organisms. Only few members of this family have been characterized and only two of them, the specific xanthine transporter XanQ from E. coli and the uric acid/xanthine transporter UapA from Aspergillus nidulans, have been studied extensively at the molecular level. Lately, the x-ray structure of another member of this family, the uracil transporter UraA, has been solved at high resolution, providing a model of how all transporters from this family are structurally organized. As a study model we use the recently cloned and functionally characterized XanQ transporter from E. coli K12, a specific, high-affinity xanthine: Η+ symporter. In the present thesis, we analyze the role of some of important residues with respect to their putative direct or indirect involvement with the substrate binding site of XanQ. We performed site-directed alkylation and functional assays of single-Cys mutants of the NAT motif and flanking regions, in the presence or absence of xanthine. The experiments indicate that two of the NAT motif residues interact directly with the xanthine binding site, Asn-325 and Gln-324 while the neighboring Ala-323 responds with a small conformational change which causes an increased sensitivity to inactivation. Moreover, residues 326-329 and residues at positions 332, 333 and 336 appear to participate in the purine permeation pathway. In the second part of the thesis, we studied the role of the C-terminal TM of XanQ. The revised model of XanQ based on the crystal structure of UraA shows that the C-terminal TM is distant from the binding site and its interaction with the NAT motif should be indirect. In the present thesis, engineering of chimera N11C1 and its “resurrection” through rational mutagenesis steps has revealed important elements for the function and evolution of XanQ which were not discernible in the previous studies. In particular, Asn-430 and Ile-432, located at the middle of this TM at the beginning of the last small alpha helix (α14), are crucial for the right conformation and expression of the transporter in the membrane, the length of the extended unstructured loop between the last two alpha helices (α13 and α14) is crucial for high xanthine uptake activity since deletion of 11 residues from this sequence is needed to restore full uptake activity in chimera N11C1. Restoration of the correct XanQ specificity, especially with respect to the non-recognition of uric acid, 7-methylxanthine and 8-methylxanthine, requires the additional re-introduction of two glycines, Gly-435 and Gly-436, in the middle of α14, while any combination of the other mutations lead to chimeras with high promiscuity for recognition of these non-XanQ ligands. The above series of mutations leads to the rebuilt of a chimera which is functionally equivalent to wild-type XanQ in terms of activity and specificity. In addition, these data are interesting from an evolutionary point of view, since the above mutations have different effects on different molecular backgrounds (XanQ, UapA, or the chimeras) and their order of appearance is crucial to achieve the optimal result with respect to the expression and functionality of the chimeric transporter.
Η οικογένεια μεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων-ασκορβικού (ΝΑΤ) περιλαμβάνει πάνω από 2000 δυνητικά μέλη και από αυτά, ελάχιστα έχουν χαρακτηριστεί λειτουργικά και μόνο δύο είναι εκτενώς μελετημένα με μεταλλαξιγένεση, ο μεταφορέας ουρικού/ξανθίνης UapA του ασκομύκητα Aspergillus nidulans και ο μεταφορέας ξανθίνης XanQ της Escherichia coli. Πρόσφατα, παρουσιάσθηκε η πρώτη κρυσταλλική δομή ενός ομολόγου της οικογένειας, του μεταφορέα ουρακίλης UraA. Ως μοριακό εργαλείο στη διατριβή χρησιμοποιήθηκε ο συμμεταφορέας ξανθίνης:Η+, XanQ. Η παρούσα διατριβή εξετάζει διεξοδικότερα ορισμένες από τις θέσεις που φαίνεται να εμπλέκονται άμεσα ή έμμεσα στο κέντρο δέσμευσης υποστρώματος. Πραγματοποιήθηκε αλκυλίωση όλων των θέσεων του μοτίβου-υπογραφή του μεταφορέα XanQ και παρακείμενων περιοχών με N-αιθυλμηλεϊμίδιο (ΝΕΜ), χρησιμοποιώντας μεταλλάγματα μονών κυστεϊνών, και μελετήθηκε η επίδραση της ξανθίνης. Τα πειράματα υποδεικνύουν ότι δύο από τις θέσεις του μοτίβου-υπογραφή βρίσκονται σε άμεση αλληλεπίδραση με το κέντρο δέσμευσης, η Asn-325 και η Gln-324. Η Ala-323 αντιδρά με μια μικρή διαμορφωτική αλλαγή που οδηγεί όμως σε αυξημένη ευαισθησία σε απενεργοποίηση. Επιπρόσθετα τα κατάλοιπα 326-329 και τα κατάλοιπα 332, 333 και 336 εμπλέκονται στο σχηματισμό του μονοπατιού διόδου της πουρίνης, Η μοντελοποίηση της πιθανής δομής του XanQ βάσει της κρυσταλλικής δομής του UraA επιβεβαιώνει ότι η περιοχή αυτή έχει άμεση σχέση με το κέντρο δέσμευσης. Επίσης μελετήθηκε ο ρόλος του C-τελικού ΤΜ του XanQ που βρίσκεται μακριά από το κέντρο δέσμευσης και η πιθανή λειτουργική αλληλεπίδρασή του με κατάλοιπα του μοτίβου-υπογραφή θα πρέπει να είναι έμμεση. Η χίμαιρα N11C1 ανέδειξε τη σημασία στοιχείων του C-τελικού TM για τη λειτουργία και την εξέλιξη του XanQ. Τα κεντρικά κατάλοιπα του C-τελικού ΤΜ, Asn-430 και Ile-432, απαιτούνται για τη σωστή διαμόρφωση και έκφραση του μεταφορέα στη μεμβράνη, το μήκος της ελεύθερης συνδετικής περιοχής μεταξύ των τελευταίων ελίκων α13 και α14 είναι σημαντικό για την ενεργότητα μεταφοράς ξανθίνης και η περικοπή αυτής της αλληλουχίας κατά 11 κατάλοιπα είναι απαραίτητη για να επανέλθει πλήρως η ενεργότητα της χίμαιρας. Τα δεδομένα παρουσιάζουν και εξελικτικό ενδιαφέρον, αφού οι παραπάνω αλλαγές έχουν διαφορετική επίπτωση ανάλογα με το υπόβαθρο όπου πραγματοποιούνται ενώ η σειρά τους έχει καθοριστική σημασία αφού η κάθε μεταλλαγή θα πρέπει να γίνει την κατάλληλη στιγμή ώστε να έχουμε το επιθυμητό αποτέλεσμα.
