Primary Biliary Cirrhosis (PBC) is an autoimmune liver disease characterized by progressive inflamatory destruction of the small intrahepatic biliary ducts leading to cirrhosis and liver failure. The serologic hallmark of PBC is the presence of antimitochondrial antibodies (AMA). The main antigenic target of AMA is the E2 subunit of Pyruvate Dehydrogenase Complex (PDC-E2). Previous studies have addressed the central role of cellular immunity in the pathogenesis of the disease. Despite the evidence on the central role of cellular immunity against the PDC-E2 protein in the pathogenesis of PBC, so far, only one study by Shimota et al has adressed the CD4+ T cell epitopes of PDC-E2. In this study, the dominant epitope was described as a peptide within the inner lipoyl domain of the protein from amino acid 163 to amino acid 176 (PDC-E2163-176). However, it is unknown whether this epitope is dominant in PBC populations outside Japan. Moreover, it is unknown whether this peptide, is the only single epitope within the protein. To date, there is lack of information of the T and B- cell PDC-E2 epitopes in Caucasians and in particular among Greek PBC patients. Accordingly, our studies aimed to address the above questions. We initially characterize the AMA reactivity in 87 PBC patients showing that using multiple techniques for the detection of AMA the sensitivity is close to 100%. Eighty sixpercent (86.2%) of the patients were tested positive for IgG AMA using HEp-2 commercial substrate by indirect immunofluoresence (IIF) whereas 83.9% of the patientswhere tested positive for AMA by IIF on rat liver, kidney and stomach sections. AMA positivity was found in 90.1% of the PBC patients with either IIF method. Using a commercial MIT-3 ELISA, 89.6% of the patients were tested positive for IgG AMA where as 79.3% were tested positive for IgA AMA using the same substrate. A total of 93.1% of the patients showed positive reaction for either IgG or IgA AMA using the MIT-3 ELISA kit. Interestingly, 98.85% (86/87) of the patients tested positive for AMA for IIF and/or ELISA, indicating that the combination of these methods is the most effective way to detect AMA. To further identify immunodominant peptides of the PDC-E2 recognized by AMA in PBC, we initially used a recombinant part of the PDC-E2 containing the inner lippoyl domain to characterize humoral anti-PDC-E2 reactivity by western blot and in house ELISA. Sera from 19 PBC patients tested positive by ELISA against 76 synthetic overlapping peptides (20 amino acids; aa) covering the entire length of the PDC-E2. Humoral specific reactivity against the peptides 15 and 16 within the PDC-E2 outer lippoyl donain, was seen in 4 (21.05%) and 5 (26.31%) patients respectively. None of the controls tested positive against these peptides. Serum for only one patient showed reactinity against a peptide (peptide 26) within the PDC-E2 inner lipoyl domain. None of the sera showed reactivity against the peptides spanning the PDC-E2 Ε1/Ε3 binding domain. Sera from 13 out of 19 patients (68.42%) showed reactivity against at least one peptide within the catalytic domain. Four clusters of epitopes were recognized within the catalytic domain (peptides 51 and 52, 59, 64 and 72-74). The above results suggest a conformational epitope within the PDC-E2 inner lipoyl domain as 100% of the the patients showed reactivity against the protein containing the PDC-E2 inner lipoyl domain whereas only one patient reacted to a peptide within the inner lipoyl domain. However, the epitopes within the catalytic domain seem to be multiple and linear.Thirty five patients with PBC were studied to characterize the PDC-E2163-176 specific T cell immune responce with IFN-γ ELISpot. Only 3/35 (8.57%) showed statistically significant T cell reactivity against PDC-E2163-176. The CD4+ T cell responce against the PDC-E2163-176 was furthermore studied with flow cytometry after stimulating with the previously characterized epitope for 7 days Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) from 21 patients. Two out of 21 patients (9.52%) showed statistically significant IFN-γ production. The differences of reactivity between patients and healthy controls was not statistically significant. Our data suggest that peptide PDC-E2163-176 is a subdominant epitope among Greek patients with PBC and a more systemic approach was necessary to identify the CD4+ T cell epitopes in this population. For this reason we used T-cell epitope prediction databases (SYFPEITHI) and programs that predict MHC-Ι and MHC-ΙΙ peptide binders from protein sequence or sequence alignments using Position Specific Scoring Matrices (Rankpep) to design 26 peptides according to our patient’s HLAs. These peptides were divided in 5 pools of peptides. Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) from 21 patients and 5 healthy controls were stimulated with these pools and the T cell immune response was measured as antigen specific IFN-γ production using an IFN-γ ELISpot assay. Statistically significant IFN-γ production was identified in 8 patients (38.1%). Seven of these 8 patient showed reactivity against one pool and 1 showed reactivity against 3 pools. These results indicated that the larger the numbers of peptides used, the wider the identified reactivity is. For this reason, we aimed to create overlapping peptides spanning the entire PDC-E2 protein. CD4+ T cell reactivity among 22 patients was evaluated with flow cytometry detecting the antigen specific response after stimulating PBMCs with 12 pools of 76, 20aa overlapping peptides spanning the entire PDC-E2. CD4 antigen specific proliferation was also studied in 10 patients after stimulating their CFSE stained, antigen stimulated CD4+ T cells. CD4+ T lymphocytes from 17 out of 22 patients (77.27%) showed statistically significant production of IFN-γ after stimulation with at least one pool. Each patient showed a distrinct pattern of reactivity against different pools of peptides with the majority of patients reacting against to more than one pools. The CD4+ T lymphocytes of nine out of 10 patients also showed statistically significant antigen specific proliferation after being stimulated with at least one pool. The majority of patients showed significant antigen specific proliferation against multiple pools (mean 5.2). Our results indicate that the CD4+ T cell immune reactivity among Greek patients with PBC is heterogenous and polyclonal.
Η Πρωτοπαθής Χολική Κίρρωση (ΠΧΚ) είναι μια χρόνια αυτοάνοση χολοστατική νόσος του ήπατος που χαρακτηρίζεται από προοδευτική φλεγμονώδη καταστροφή των μικρού μεγέθους ενδοηπατικών χοληφόρων που οδηγεί σε μη αναστρέψιμη κίρρωση και ηπατική ανεπάρκεια. Ορολογικά, η ΠΧΚ χαρακτηρίζεται από την παρουσία υψηλού τίτλου αντι-μιτοχονδριακών αντισωμάτων (anti-mitochondrial antibody, ΑΜΑ). Ο βασικός αντιγονικός στόχος των ΑΜΑ στην ΠΧΚ είναι η Ε2 υπομονάδα της πυρουβικής δευδρογενάσης (PDC-E2), η οποία και αναγνωρίζεται σε ποσοστό μεγαλύτερο από 95% των ασθενών. Παλαιότερες μελέτες έχουν καταδείξει τη σημασία της κυτταρικής ανοσίας στην παθογένεια της νόσου. Παρά τον κατά γενική ομολογία πρωτεύοντα ρόλο της ειδικής έναντι του PDC-E2 CD4+ κυτταρικής ανοσολογικής απάντησης στην παθογένεια της νόσου υπάρχει μόνο μια μελέτη σε Ιάπωνες ασθενείς με ΠΧΚ που προσδιορίζει τους CD4+ λεμφοκυτταρικούς PDC-E2 επιτόπους. Στην εν λόγω μελέτη έχει περιγραφεί ως επικρατών επίτοπος το πεπτίδιο της PDC-E2163-176. Παρεμένει ωστόσο άγνωστο αν αυτός ο επίτοπος αναγνωρίζεται και από τα CD4+ T λεμφοκύτταρα ασθενών από άλλες πληθυσμιακές ομάδες πλην των Ιαπώνων. Παράλληλα δεν είναι επίσης γνωστό αν ο συγκεκριμένος επίτοπος είναι και ο μοναδικός. Είναι επίσης ενδιαφέρον, ότι στη χώρα μας δεν υπάρχουν δεδομένα που να αφορούν στη χαρτογράφηση των επιτόπων της PDC-E2 ασθενών με ΠΧΚ σε επίπεδο χυμικής ανοσίας. Στην παρούσα διατριβή επιχειρήσαμε να συμπληρωθούν τα παραπάνω βιβλιογραφικά κενά. Από τη μελέτη και το χαρακτηρισμό των ΑΜΑ προέκυψε το συμπέρασμα ότι η ταυτοποίηση των αυτοαντισωμάτων αυτών με πολλαπλές και παράλληλες μεθόδους αυξάνει την ευαισθησία για την ανίχνευσή τους. Αναλυτικότερα, στα πειράματα για το χαρακτηρισμό των ΑΜΑ με πειράματα ανοσοφθορισμού θετικά ελέχθηκαν 86.2% σε υπόστρωμα HEp-2 ενώ αυτό το ποσοστό σε υπόστρωμα ήπατος-νεφρού-στομάχου αρουραίου ήταν 83.9%. Θετικοί για την παρουσία ΑΜΑ σε πειράματα ανοσοφθορισμού σε τουλάχιστον ένα υπόστρωμα ήταν το 90,1% των ασθενών με ΠΧΚ. Με την μέθοδο της ELISA με την υβριδική πρωτεΐνη ΜΙΤ-3 τα αντίστοιχα ποσοστά ήταν για τα μεν IgG 89.6% τα δε IgA 79.3% (69 ασθενείς) ενώ το ποσοστό αυτό όταν μια από τις δύο αυτές κλάσεις ή και οι δύο ήταν θετικές ήταν 93.1% (81 ασθενείς). Ογδόντα έξι ασθενείς (98.85%) ελέγχθηκαν θετικοί για την παρουσία ΑΜΑ με τουλάχιστον μια από τις 4 μεθόδους. Φαίνεται ότι ο συνδιασμός ELISA και ΕΑΦ είναι η πιο αποτελεσματική προσέγγιση για την ανίχνευση των ΑΜΑ. Για το χαρακτηρισμό της χυμικής ανοσολογικής απόκρισης έναντι 76 20μερών, αλληλεπικαλυπτομένων κατά 8 αμινοξέα πεπτιδίων που καλύπτουν ολόκληρο το εύρος της PDC-E2, χρησιμοποιήσαμε ορούς από 19 ασθενείς με ΠΧΚ με τεκμηριωμένη παρουσία ΑΜΑ και ειδικότερα αντι-PDC-E2 αντισωμάτων κατά της έσω λιποϋλικής περιοχής της PDC-E2. Αντιδραστικότητα σε τουλάχιστον ένα από τα πεπτίδια που αντιστοιχούν στο έξω λιποϋλικό τμήμα της PDC-E2 παρουσίασαν 5 ασθενείς (26.31%) και 1 μάρτυρας. Τα πεπτίδια που τουλάχιστον ένας ασθενής παρουσίασε αντιδραστικότητα ήταν τα 11, 15 και 16. Η αντιδραστικότητα κατά του πεπτιδίου 11 ήταν μη ειδική καθώς θετική απόκριση έδωσαν τόσο ένας ασθενής όσο και ένας μάρτυρας. Αντιδραστικότητα κατά του πεπτιδίου 15 και 16 είχαν 4 (21.05%) και 5 (26.31%) ασθενείς αντίστοιχα ενώ κανένας μάρτυρας δεν παρουσίασε αντιδραστικότητα κατά αυτών των πεπτιδίων. Ενώ όλοι οι ασθενείς ελέγχθηκαν θετικά για την παρουσία αντισωμάτων κατά της έσω λιποϋλικής περιοχής τόσο με πειράματα ανοσοαποτύπωσης όσο και με πειράματα ELISA, μόνο ένας ασθενής παρουσίασε αντιδραστικότητα σε ένα πεπτίδιο (πεπτίδιο 26) που αντιστοιχεί στο έσω λιποϋλικό τμήμα της PDC-E2. Τρεις υγιείς μάρτυρες παρουσίασαν αντιδραστικότητα σε κάποιο από τα πεπτίδια που αντιστοιχούν στο έσω λιποϋλικό τμήμα. Η έλλειψη αντιδραστικότητας κατά των πεπτιδίων από ορούς που αντιδρούν με το έσω λιποϋλικό τμήμα της PDC-E2 δυνατόν να συμβαίνει επειδή ο επίτοπος των ΑΜΑ στο έσω λιποϋλικό τμήμα είναι στερεοτακτικός. Το ποσοστό αντιδραστικότητας κατά της θέσης σύνδεσης των υπομονάδων Ε1/Ε3 ήταν 0% ανάμεσα στους ασθενείς με ΠΧΚ. Η περιοχή που αντιστοιχεί στο καταλυτικό κομμάτι της PDC-E2 ήταν η πλέον ενδιαφέρουσα από πλευράς αντιδραστικότητας. Συνολικά 13 ασθενείς (68.42%) παρουσίασαν αντιδραστικότητα σε τουλάχιστον ένα πεπτίδιο που αντιστοιχεί στο καταλυτικό τμήμα της πρωτεΐνης. Συνολικά 4 περιοχές φαίνεται να ξεχωρίζουν ως προς την αντιδραστικότητα σε σχέση με τους μάρτυρες: οι περιοχές που καλύπτονται από τα πεπτίδια 51 και 52, 59, 64, 72 και 74. Σε σύνολο 35 ασθενών που μελετήθηκε η ειδική T λεμφοκυτταρική ανοσολογική απάντηση ως παραγωγή IFN-γ σαν απάντηση στη διέγερση με το πεπτίδιο PDC-E2163-176 (προηγούμενα περιγραφόμενος επίτοπος) μόνο 3 (8.57%) παρουσίασαν στατιστικά σημαντική παραγωγή IFN-γ και είναι η πρώτη φορά που περιγράφεται ποσοστό αναγνώρισης του προηγούμενα χαρακτηριζόμενου επιτόπου σε Καυκάσιους ασθενείς. Στα πειράματα κυτταρομετρίας ροής που έγιναν, σημαντική παραγωγή IFN-γ από τα CD4+ λεμφοκύτταρα παρατηρήθηκε μόνο σε 2 από τους 21 ασθενείς (9.52%). Η περαιτέρω ανάλυση των δεδομένων τόσο σε ασθενείς με ΠΧΚ όσο και σε υγιείς μάρτυρες έδειξε ότι δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ της ανοσολογικής απόκρισης μεταξύ των 2 ομάδων. Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν ότι ο επίτοπος αυτός δεν είναι ο επικρατούν ανάμεσα στους Έλληνες ασθενείς με ΠΧΚ και έτσι έγινε μια πιο συστηματική προσέγγιση στη μελέτη της κυτταρικής ανοσολογικής απάντησης.Το επόμενο βήμα ήταν η μελέτη της ειδικής ανοσολογικής απόκρισης της T κυτταρικής ανοσίας σε 21 ασθενείς με ΠΧΚ και 5 υγιείς μάρτυρες έναντι 26 πεπτιδίων που δημιουργήθηκαν και χωρίστηκαν σε 5 δεξαμενές πεπτιδίων (Pools) με τη μέθοδο της IFN-γ ELISpot. Οι 19 από τους 21 ασθενείς έδειξαν μεγαλύτερη αντιδραστικότητα όταν τα PBMCs τους καλλιεργήθηκαν με κάποια από τις Pools σε σχέση με την αντιδραστικότητα που παρουσίασαν όταν καλλιεργήθηκαν παρουσία μόνο καλλιεργητικού υλικού. Στατιστικά σημαντική αντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε μόνο σε 8 (38.1%) ασθενείς με ΠΧΚ σαν απάντηση σε κάποια από τις 5 Pools πεπτιδίων. Στην επόμενη και τελική φάση της μελέτης αναζητήθηκαν πιθανοί επίτοποι των CD4+ T λεμφοκυττάρων ανάμεσα σε 22 ασθενείς με ΠΧΚ με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής, χρησιμοποιώντας 76 20μερή πεπτίδια που κάλυπτουν ολόκληρη την αλληλουχία της PDC-E2 και που χωρίσθηκαν σε 12 δεξαμενές πεπτιδίων. Παράλληλα, στους 10 από αυτούς τους 22 ασθενείς μελετήθηκε πώς τα CD4+ T λεμφοκύτταρα τους πολλαπλασιάζονται όταν καλλιεργηθούν με τις 12 Pools πεπτιδίων που δημιουργήσαμε. Σε σύνολο 22 ασθενών, οι 17 (77.27%) παρουσίασαν στατιστικά σημαντική παραγωγή IFN-γ από τα CD4+ T λεμφοκύτταρα τους σε τουλάχιστον μια δεξαμενή όταν τα PBMCs καλλιεργούνταν παρουσία των δεξαμενών πεπτιδίων. Ο κάθε έκαστος ασθενής παρουσίαζε αντιδραστικοτήτητα σε διαφορετικές δεξαμενές πεπτιδίων ενώ η πλειονότητα των ασθενών παρουσίασε αντιδραστικότητα σε περισσότερες της μιας δεξαμενές πεπτιδίων. Όταν μελετήθηκε ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, από τους 10 ασθενείς με ΠΧΚ οι 9 (90%) έδειξαν να έχουν στατιστικά σημαντικό ποσοστό CD4+ Tλεμφοκυττάρων που πολλαπλασιάζονταν παρουσία τουλάχιστον μιας δεξαμενής πεπτιδίων σε σχέση με το πολλαπλασιασμό που παρατηρούταν όταν τα κύτταρα καλλιεργούνταν απουσία αντιγόνου. Τα λεμφοκύτταρα των 10 αυτών ασθενών παρουσίασαν κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε περισσότερες της μιας δεξαμενής πεπτιδίων (μέσος όρος 5.2). Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν ότι η ειδική Τ κυτταρική ανοσολογική απόκριση σε Έλληνες ασθενείς με ΠΧΚ είναι ετερογενής και πολυκλωνική.
