Η β-μεσογειακή αναιμία (β-ΜΑ) αποτελεί μια από τις συχνότερες μονογονιδιακές νόσους με εκτιμώμενο αριθμό 80 εκατομμυρίων φορέων παγκοσμίως. Σήμερα, βασική θεραπευτική αγωγή αποτελεί η δια βίου, τακτική μετάγγιση αίματος, με συγχορήγηση σιδηροδεσμευτικών χηλικών ουσιών. Στο οπλοστάσιο των εναλλακτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων συγκαταλέγονται η αλλογενής μεταμόσχευση μυελού των οστών από ιστοσυμβατούς δότες, αλλά και η αυτόλογη μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (ΑΑΚ) μετά από γενετική διόρθωση, στα πλαίσια των προσεγγίσεων γονιδιακής θεραπείας. Η παρούσα μελέτη αποτελεί μια εναλλακτική προσέγγιση στη γονιδιακή θεραπεία της β-θαλασσαιμίας, που στοχεύει στη μείωση της παθολογικής περίσσειας των αλυσίδων της α-σφαιρίνης. Η ελαττωμένη παραγωγή β-σφαιρίνης, σε συνδυασμό με τη φυσιολογική σύνθεση της α-σφαιρίνης, οδηγεί στην ποσοτική περίσσεια των α-αλυσίδων και ακολούθως στην κατακρήμνιση τους, με αποτέλεσμα την απόπτωση και την πρόωρη καταστροφή των πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των οστών [μη αποδοτική ερυθροποίηση). Η σημασία της διερεύνησης της α-σφαιρίνης ως θεραπευτικού στόχου έχει επιβεβαιωθεί και από περιπτώσεις ασθενών με διπλή ετεροζυγωτία για την α- και τη β-θαλασσαιμία στους οποίους έχει παρατηρηθεί βελτίωση του κλινικού φαινοτύπου. Η ανάπτυξη μιας εναλλακτικής προσέγγισης στη γονιδιακή στόχευση της β-μεσογειακής αναιμίας στηρίχτηκε στο μηχανισμό της παρεμβολής του RNA (RNA interference, RNAi), που αφορά στη διαδικασία της εξειδικευμένης μεταμεταγραφικής αποσιώπησης συγκεκριμένης ακολουθίας μορίων mRNA. Η αξιοποίηση της τεχνολογίας του RNAi αποτελεί πλέον σημαντικό εργαλείο, τόσο για τη βασική έρευνα, όσο και τη ρύθμιση κλινικά σημαντικών γονιδίων. Θεωρητικά, κάθε ασθένεια που προκαλείται από την ενεργοποίηση ενός ή περισσοτέρων γονιδίων μπορεί να αντιμετωπιστεί με τη μέθοδο του RNAi, ενώ θεραπευτικές εφαρμογές ήδη βρίσκονται στο στάδιο των κλινικών δοκιμών. Η επαγωγή μιας θεραπευτικά σημαντικής μείωσης της α-σφαιρίνης στη β-μεσογειακή αναιμία, απαιτεί τη σταθερή αποσιώπηση της στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα των ασθενών. Μόνη επιλογή για την επίτευξη σταθερής γονιδιακής αποσιώπησης αποτελεί η έκφραση των μορίων siRNA από ιϊκούς φορείς, ικανούς να ενσωματώνονται σταθερά στο γονιδίωμα των κυττάρων-στόχων. Οι φορείς επιλογής στην παρούσα εργασία είναι οι φορείς από αφροϊούς (FV-foamy viruses), οι οποίοι ανήκουν στην υποοικογένεια Spumaretrovirinae των ρετροϊών, με σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι των υπολοίπων ιϊκών φορέων. Φυσικοί φορείς των αφροϊών είναι τα πιθηκοειδή, στα οποία δεν έχουν ενοχοποιηθεί για κάποιο νόσημα, Στα πλεονεκτήματα των αφροϊικών φορέων περιλαμβάνονται ο εξαιρετικά ευρύς κυτταρικός τροπισμός, ένα ευνοϊκό πρότυπο ενσωμάτωσης μακριά από κώδικές αλληλουχίες, η ικανότητα παραμονής σε μη-διαιρούμενα κύτταρα (φάση G0) και η αποτελεσματική διαμόλυνση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Οι ιδιότητες αυτές τους καθιστούν ιδιαίτερα υποσχόμενη τεχνολογία σε σχέση με τους γ-ρετροϊούς και τους λεντοϊούς, ειδικά από άποψη κλινικής ασφάλειας. Ο βασικός πειραματικός όγκος της παρούσας διατριβής επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη και αξιολόγηση νέων αφροϊικών φορέων-RNAi, ικανών να επάγουν σταθερή γονιδιακή αποσιώπηση, με τελικό στόχο την εφαρμογή τους στη μείωση της α-σφαιρίνης στη β-μεσογειακή αναιμία. Χρησιμοποιώντας απενεργοποιημένους αφροϊικούς φορείς τρίτης γενιάς (ΔΦ) που εκφράζουν μόρια shRNA υπό τον έλεγχο των υποκινητών της RNA Pol III (mU6 του ποντικού και Η1 του ανθρώπου) μελετήθηκε λεπτομερώς η εφαρμογή των φορέων FV στην επαγωγή του μηχανισμού RNAi. Μέσω μια σειράς πιλοτικών πειραμάτων για τη μελέτη της αποσιώπησης του γονιδίου-μάρτυρα GFP σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές in vitro, αλλά και σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα ex vivo και in vivo, δείχτηκε ότι και οι δύο τύποι υποκινητών επάγουν υψηλά επίπεδα αποσιώπησης με πτώση της έκφρασης της GFP έως το 60% της αρχικής τιμής, ακόμα και με ένα ενσωματωμένο αντίγραφο φορέα (ΜOI<1). Παρόλα αυτά, η σταθερή έκφραση μορίων shRNA από τους φορείς με τον υποκινητή mU6 ήταν τοξική στις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν, οδηγώντας σε προοδευτική απόπτωση των διαμολυσμένων κυττάρων. Αντίθετα, οι φορείς με τον υποκινητή Η1, ήταν αποτελεσματικοί και σταθεροί in vitro, υποδεικνύοντας τη σημασία της συνολικής κυτταρικής φυσιολογίας στην εκτίμηση των παρατηρούμενων επιδράσεων. Η αποτελεσματικότητα των φορέων Η1 ήταν σταθερή και στην αποσιώπηση του ογκογονιδίου BCR-ABL στην λευχαιμική σειρά Κ562, ενισχύοντας τη δυνατότητα εφαρμογής των αφροϊικών φορέων-RNAi στην κατευθυνόμενη θεραπεία νεοπλασματικών διαταραχών, όπως η χρόνια μυελογενής λευχαιμία. Σε αντίθεση με τα ανθρώπινα κύτταρα, οι φορείς mU6 ήταν ικανοί για αποτελεσματική και σταθερή αποσιώπηση στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα του ποντικού, τόσο ex vivo, όσο και in vivo. Σε μοντέλο μεταμόσχευσης μυελού των οστών, η ελάττωση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου στα μεταμοσχευμένα ζώα έφτασε το 70- 90%, έως και 3 μήνες μετά τη μεταμόσχευση. Η τεχνογνωσία που αποκτήθηκε, εφαρμόστηκε στη στόχευση της περίσσειας των α-αλυσίδων στη β-μεσογειακή αναιμία, μελετώντας έναν αριθμό διαφορετικών μορίων shRNA κατά της α-σφαιρίνης του ανθρώπου και του ποντικού. Η αρχική επιλογή των αποτελεσματικότερων αλληλουχιών shRNA έγινε in vitro, στις ερυθρολευχαιμικές σειρές MEL του ποντικού και Κ562 του ανθρώπου. Τρεις, τουλάχιστον, αλληλουχίες μορίων shRNA για κάθε είδος, ήταν ικανές να επάγουν σταθερή μείωση του mRNA της α-σφαιρίνης του ποντικού (10-20%) και του ανθρώπου (έως και 50%) ακόμα και σε χαμηλό MOI (1-5), που ήταν ανιχνεύσιμη και σε επίπεδο πρωτεΐνης. Τα αποτελέσματα στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα ήταν ακόμα πιο ενθαρρυντικά. Όλα τα υποψήφια μόρια shRNA μείωσαν αποτελεσματικά την έκφραση της α-σφαιρίνης κατά 70-85% στο ποντίκι και 50-95% στον άνθρωπο. Σε λειτουργικό επίπεδο, παρατηρήθηκε ότι η μείωση της α-σφαιρίνης σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα φυσιολογικών ατόμων επάγει μια φαινοτυπική κατάσταση «α-θαλασσαιμίας», που συνοδεύεται από την αυξημένη ερυθροποίηση που παρατηρείται στα θαλασσαιμικά σύνδρομα. Ανάλογες λειτουργικές μελέτες στο θαλασσαιμικό μοντέλο ποντικού th3/+, έδειξαν ότι η ελάττωση της περίσσειας της α-σφαιρίνης κατά 40-50% επιφέρει μια γενικότερη αποκατάσταση της φυσιολογικής διαδικασίας ερυθροποίησης, όπως τεκμηριώθηκε με τη διόρθωση της κλωνογόνου ικανότητας των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (αριθμός αποικιών BFUe) και τη μεταβολή των δεικτών ερυθροποίησης (CD71/Terll9). Η παρούσα μελέτη περιλαμβάνει, για πρώτη φορά, τη λεπτομερή ανάλυση του συστήματος των αφροϊικών φορέων στην επαγωγή του μηχανισμού RNAi, παρέχοντας σημαντικές πληροφορίες για τους περιορισμούς και την αποτελεσματικότητα της τεχνολογίας. Επιπλέον, εξετάζει αναλυτικά τα ποσοτικά χαρακτηριστικά της μείωσης της α-σφαιρίνης, σε διαφορετικά κυτταρικά συστήματα του ανθρώπου και του ποντικού και τις επακόλουθες λειτουργικές επιδράσεις στην πορεία της ερυθροποίησης. Τα αποτελέσματα της μελέτης υποδεικνύουν ότι η αποσιώπηση της α-σφαιρίνης, τουλάχιστον ex vivo, επάγει μια γενικότερη λειτουργική κατάσταση «α-θαλασσαιμίας», η οποία μπορεί να δράσει εξισορροπητικά στην ποσοτική περίσσεια των α-αλυσίδων στη β-μεσογειακή αναιμία, επάγοντας τη βελτίωση του θαλασσαιμικού φαινοτύπου. Η παρούσα εργασία αποδεικνύει τόσο τη θεραπευτική χρησιμότητα του συστήματος των φορέων από αφροϊούς για RNAi, όσο και την αξία της α-σφαιρίνης στη στοχευμένη γονιδιακή θεραπεία της β-μεσογειακής αναιμίας.
Aim of the present study was the development of foamy virus (FV) vectors for efficient and stable RNAi, and their deployment in gene therapy approaches for beta-thalassemia. Initially, by using GFP as a target gene, we examined the efficiency of FV vectors harbouring the mouse U6 (mU6) and human Hl RNA Pol III promoters in different human cell lines and mouse hematopoietic stem cells (HSC) and showed that both vector types mediated very efficient gene silencing, with as low as one vector copy per cell. We also examined the difference in the silencing efficiency of the two promoters, as well as the impact of the expression system and cellular context in the evaluation of the overall RNAi effects. The efficiency of the HI vectors was further shown by the successful silencing of BCR-ABL oncogene, whereas mU6 vectors also induced efficient and stable gene silencing in vivo, following bone marrow transplantation. In the context of beta-thalassemia, we designed and cloned candidate shRNAs targeting the mouse and human alpha-globin, for the down-regulation of its expression and the amelioration of the alpha-chain imbalance, which is the main pathophysiological feature of the disease. Initial experiments performed in vitro using mouse MEL and human K562 cells, identified at least two shRNAs for each species, capable of efficient and sustained downregulation, even at low MOI (1-5). Ex vivo, functional studies using HSCs of both mouse and human origin, confirmed the efficiency of all candidate shRNA sequences in down-regulating a-globin by 50 to 10% and indicated that a-globin silencing can induce an erythroid differentiation that assimilates the aberrant erythropoiesis in thalassemic syndromes. In ex vivo experiments with HSCs from β-thalassemic mice, this FV-RNAi induced “alpha-thalassemia” was accompanied by the restoration of a balanced context of erythropoiesis, as depicted by the normalisation of BFU-E numbers and the expression of erythroid markers. Collectively, the present study supports the dynamic of the FV-RNAi system in the efficient and functional down-regulation of excess alpha-globin, further supporting its clinical validity as a therapeutic target for β-thalassemia.
