Μοριακή μελέτη βασικοκυτταρικών καρκινωμάτων δέρματος

 
This item is provided by the institution :

Repository :
National Archive of PhD Theses
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share



PhD thesis (EN)

2011 (EN)
Molecular study of basal cell carcinomas
Μοριακή μελέτη βασικοκυτταρικών καρκινωμάτων δέρματος

Σταματέλλη, Αγγελική

Εισαγωγή: Το βασικοκυτταρικό καρκίνωμα (Basal Cell Carcinoma) είναι το πιοσυχνό κακόηθες δερματικό νεόπλασμα το οποίο αναπτύσσεται αργά και σπάνιαμεθίσταται. Η υπερβολική έκθεση στον ήλιο (υπεριώδης ακτινοβολία), η φυλή, η ηλικία,το φύλο καθώς και γενετικοί παράγοντες συμβάλλουν στην ανάπτυξη τουβασικοκυτταρικού καρκινώματος.Σκοπός: Σκοπός της εργασίας αυτής ήταν η αναζήτηση του ρόλου τηςανεπάρκειας του επιδιορθωτικού μηχανισμού MMR (mismatch repair) στηνκαρκινογένεση του βασικοκυτταρικού καρκινώματος του δέρματος, μέσω ανίχνευσηςμικροδορυφορικής αστάθειας (microsatellite instability, MSI), μελέτης των επιπέδωνέκφρασης των βασικών γονιδίων επιδιόρθωσης (MMR) hMLH1, hMSH2 και αναζήτησηςμεταλλαγών στις κωδικές μικροδορυφορικές μονονουκλεοτιδικές αλληλουχίες τωνγονιδίων στόχων της μικροδορυφορικής αστάθειας TGF-βRII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6και Caspase 5. Μελετήθηκε επίσης η έκφραση της πρωτεΐνης p53 η οποία σχετίζεται μετην εμφάνιση του βασικοκυτταρικού καρκινώματος και τέλος η παρουσία μεταλλαγώνστο εξώνιο 15 του γονιδίου B-Raf το οποίο σχετίζεται με το σηματοδοτικό μονοπάτι Rasτο οποίο μονοπάτι είναι γνωστό πως συνδέεται με την παθογένεση όγκων του δέρματοςόπως είναι τα ακανθοκυτταρικά καρκινώματα (squamous cell carcinonomas, SCCs) και τακακοήθη μελανώματα. Στόχος της μελέτης είναι η σύγκριση των ευρημάτων με τα κλινικάκαι παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των υπό μελέτη βασικοκυτταρικώνκαρκινωμάτων.Υλικό και Μέθοδοι: Μελετήθηκαν συνολικά 84 δείγματα από ασθενείς μεβασικοκυτταρικό καρκίνωμα. Για την ανίχνευση της μικροδορυφορικής αστάθειαςαναλύθηκαν οι μικροδορυφορικοί δείκτες BAT25, BAT26, ΒΑΤ40 (μονονουκλεοτιδικοίδείκτες) και D2S123, D5S346, D17S250 (δινουκλεοτιδικοί δείκτες) με εφαρμογή των μεθόδων αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και κάθετη ηλεκτροφόρηση. Για τηνανίχνευση μεταλλαγών στα γονίδια στόχους της μικροδορυφορικής αστάθειας TGF-βRII,IGFIIR, hMSH3, hMSH6 και Caspase 5 και του γονιδίου B-Raf, εφαρμόστηκαν οιμέθοδοι PCR και πολυμορφισμοί διαμόρφωσης μονόκλωνης αλυσίδας (SSCPs). Στηνπερίπτωση ανίχνευσης μεταλλαγής ακολούθησε ταυτοποίηση με τη μέθοδο τηςαλληλούχισης κατά Sanger (sequencing).Η έκφραση των πρωτεϊνών hMLH1, hMSH2 και p53 εκτιμήθηκεανοσοϊστοχημικά.Αποτελέσματα: Μικροδορυφορική αστάθεια ανιχνεύτηκε σε ποσοστό 7% τωνβασικοκυτταρικών καρκινωμάτων. Οι αλλαγές που παρατηρήθηκαν αφορούσαν μόνοστους μονονουκλεοτιδικούς δείκτες BAT26 και BAT25.Σε ποσοστό 5% των περιπτώσεων παρατηρήθηκε μεταλλαγή στηνεπαναλαμβανόμενη αλληλουχία των 10 αδενίνων του γονιδίου TGF-βRII. Εξέταση τουμονονουκλεοτιδικού τμήματος των 8 αδενίνων στο γονίδιο hMSH3 αποκάλυψε αλλαγέςμήκους σε 4 από τις 84 περιπτώσεις (5%). Μία από αυτές εμφάνισε μεταλλαγή και στηνεπαναλαμβανόμενη αλληλουχία του γονιδίου της Caspase 5. Δεν βρέθηκαν μεταλλαγέςστις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες των γονιδίων IGFIIR και hMSH6.Μεταλλαγές στο γονίδιο Β-Raf ανιχνεύθηκαν σε δύο από τις ογδόντα τέσσεριςπεριπτώσεις. Στην πρώτη περίπτωση παρατηρήθηκε σημειακή μεταλλαγή στονουκλεοτίδιο 1829 και συγκεκριμένα η μεταστροφή Τ→Α (c.1829T>A) που οδηγεί σεαντικατάσταση της φαινυλαλανίνης από ισολευκίνη p.(F610I) στην πρωτεΐνη B-Raf. Στηδεύτερη περίπτωση παρατηρήθηκε η μετάπτωση C→Τ στο νουκλεοτίδιο 1790(c.1790C>T) το οποίο οδηγεί στη σιωπηλή μεταλλαγή p.(L597L). Σε κανένα από ταδείγματα δεν ανιχνεύθηκε η μεταλλαγή p.(V600E), η πιο συχνά παρατηρούμενημεταλλαγή του εξωνίου 15 του B-Raf. Δεν ανιχνεύτηκε καμία στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των υπό μελέτη παραμέτρων με τους ιστολογικούς υπότυπους τουβασικοκυτταρικού καρκινώματος, με την επιθετικότητα των καρκινωμάτων ή με άλλακλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά.Συμπεράσματα: Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε πως η μικροδορυφορικήαστάθεια φαίνεται να παίζει περιορισμένο ρόλο στην καρκινογένεση τουβασικοκυτταρικού καρκινώματος. Επιπλέον δε συσχετίζεται με την έκφραση τωνπρωτεϊνών hMLH1, hMSH2 και p53 πρωτεϊνών. Μεταλλαγές στα γονίδια στόχους τηςμικροδορυφορικής αστάθειας φαίνεται να συμβαίνουν σε συγκεκριμένες περιπτώσειςβασικοκυτταρικών καρκινωμάτων οι οποίες δε σχετίζονται πάντα με την ύπαρξημικροδορυφορικής αστάθειας.Μεταλλαγές στο γονίδιο B-Raf σπάνια παρουσιάζονται στα βασικοκυτταρικάκαρκινώματα και κανένα από τα υπό μελέτη βασικοκυτταρικά καρκινώματα δενπαρουσίασε τη πιο συχνή μεταλλαγή V600E.Προτείνεται η ανάλυση περισσότερων μονονουκλεοτιδικών δεικτών για τηνπεραιτέρω διερεύνηση του ρόλου της μικροδορυφορικής αστάθειας στην ανάπτυξη τουβασικοκυτταρικού καρκινώματος καθώς και η ανάλυση επιπρόσθετων γονιδίων στόχων.Προτείνεται η διερεύνηση της εμπλοκής του μονοπατιού μεταγωγής σήματος τωνMAP κινασών Raf/MEK/ERK στα επίπεδα των MEK και ERK MAP κινασών.
Introduction: Basal Cell Carcinoma (BCC) is the most common malignant skinneoplasm developing slowly and metastasizing rarely. Sun overexposure (ultravioletirradiation - UV), race, age, sex as well as genetic factors contribute to the development ofBasal Cell Carcinoma.Aim: The aim of the present study was to investigate the role of mismatch repairsystem (MMR) deficiency regarding oncogenesis of Basal Cell Carcinoma of the skin,through the analysis of microsatellite instability (MSI), the study of expression levels offundamental mismatch repair genes - hMLH1 and hMSH2 - and the detection ofalterations in microsatellites located in coding regions of five genes, TGF-βRII, IGFIIR,hMSH3, hMSH6 και Caspase 5 that are known targets for mutations in MSI-high tumors.We further studied the expression of p53 protein on this neoplasia, as p53 gene is amajor target of UV for BCC induction. Finally we investigated the presence of B-Rafmutations in BCCs, a gene that is related to Ras signalling pathway which is known to beinvolved in the pathogenesis of cutaneous tumours such as squamous cell carcinonomas(SCC) and malignant melanomas. The objective of this study was to evaluate anycorrelation of our findings with the clinicopathological features of the analyzed Basal CellCarcinomas.Material and Methods: A total of 84 specimens from patients diagnosed withBCC were studied. For MSI assessment the mononucleotide microsatellite markers, BAT-25, BAT-26 and ΒΑΤ40 and the dinucleotide markers D2S123, D5S346, D17S250 wereanalyzed elaborating polymerase chain reaction (PCR) and electrophoresis on 25%polyacrylamide gel, followed by silver staining. Mutations in short repetitive codingsequences within the known target genes of MSI, TGF-βRII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 καιCaspase 5, as well as mutations in the B-Raf gene were investigated using PCR, single stranded conformation polymorphism (SSCP) and DNA sequencing. The expression ofhMLH1, hMSH2 and P53 proteins was evaluated by immunohistochemical analysis.Results: MSI was detected in 7% of the BCCs studies and the only markers alteredwere the mononucleotide ones, BAT26 and BAT25. Frameshift mutations in the (A)10 tractof the TGF-bRII were identified in 5% of the cases. In four out of the eighty four BCCs(5%) the (A)8 tract of the hMSH3 gene was altered. One of those cases was also altered inthe (A)10 tract of Caspase 5. No mutations were observed in the (G)8 tract of IGFIIR or inthe (C)8 tract of hMSH6. B-Raf mutations were detected in two cases out of the eighty fourBCCs examined: a T to A transversion at nucleotide 1829 (c.1829T>A) leading to anexchange from phenylalanine to isoleucine p.(F610I) and a C to T transition at 1790nucleotide (c.1790C>T) leading however to a silent mutation p.(L597L). The commonV600E point mutation was not detected in any BCC sample.Analysis of correlation between the above mentioned parameters with theclinicopathological features of the BCCs such as the histological subtypes or theaggressiveness of the carcinomas revealed no considerable associations.Conclusions: Our results suggest that MSI appears to play a minor role in thepathogenesis of BCCs. Moreover, no correlation between MSI and hMLH1, hMSH2 orp53 protein expression was determined. Furthermore, changes in repetitive sequences ofMSI target genes are uncommon in non-melanoma skin cancer occurring in a minorsubgroup of BCCs not always in association with MSI. B-Raf is rarely mutated in BCCand none of the studied BCC harboured the most frequent mutation V600E.The role of microsatellite instability in the carcinogenesis of Basal Cell Carcinomamandates further study focusing on the analysis of additional mononucleotide markers aswell as additional MSI target genes. Finally, the implication of the MAP kinase Raf/MEK/ERK signalling pathway in the pathogenesis of BCC at the levels of MEK andERK MAP kinases is also worth investigating.

Μικροδυναμική αστάθεια
Basal cell carcinoma
Βασικοκυτταρικό καρκίνωμα
Skin
Microsatellite instability ( MSI )
BRAF
Δέρμα
DNA mismatch repair system
Σύστημα επιδιόρθωσης λανθασμένα ζευγαρωμένων βάσεων του DNA
p53

Εθνικό Κέντρο Τεκμηρίωσης (ΕΚΤ) (EL)
National Documentation Centre (EKT) (EN)

Greek

2011


National and Kapodistrian University of Athens
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών (ΕΚΠΑ)



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)