Ανάπτυξη ηλεκτροχημικών αισθητήρων για την ανίχνευση ζιζανιοκτόνων που αναστέλλουν τα φωτοσυστήματα

Development of electrochemical sensors for the detection of photosystem inhibiting herbicides

Ανάπτυξη ηλεκτροχημικών αισθητήρων για την ανίχνευση ζιζανιοκτόνων που αναστέλλουν τα φωτοσυστήματα

Giannoudi, Louisa

Γιαννούδη, Λουίζα

PhD Thesis

2005

The objective of the present work is the development of an amperometric sensor for detection of hydrogen peroxide and its integration with spinach chloroplasts for the further development of a sensor for herbicides. The design of the sensor employed screen-printing electrodes which are easily produced at the facilities available in Cranfield University. The hydrogen peroxide sensor has been based on horseradish peroxidase (HRP) as the catalytic element and hydroquinone as the mediator. HRP has been immobilised onto the sensor surface using a newly developed thioacetale-based polymer capable of covalent immobilisation of primary amines. A new HRP-based biosensor was screen-printed using a carbon/polymer mixture. Hydrogen peroxide concentrations were analysed at the reduction potential of hydroquinone (–0.3 V). The biosensors developed in this work had low detection limit of H2O2 (0.1 µM), long term stability (they can be stored for 2 months at 4 oC) and good reproducibility of measurements (RSD ~ 5%). The hydrogen peroxide sensor has been further integrated with spinach chloroplasts in an attempt to create a sensor for photosynthesis-inhibiting herbicides. It was found however that the quantity of H2O2 generated by chloroplasts in our experimental conditions was not sufficient to allow quantitative analysis. Due to this we have developed an alternative approach based on the electrochemistry of the Hill reaction. In this reaction the photosynthetic process and electron flow passing through photosystem II (PSII) is monitored through the quantity of reduced artificial electron acceptor. Upon illumination of the chloroplasts a signal from a reduced acceptor or mediator was recorded chronoamperometrically. The added herbicide inhibits the photosynthetic process and decreases the reduction of mediator. The decrease in measured current which is proportional to herbicide concentrations have been used for herbicide detection. Three mediators of Hill reaction were tested including 2,6 dichlorophenolindophenol (DCPIP) duroquinone and potassium ferricyanide. The optimal results were obtained using DCPIP. The optimal wavelength for the excitation of chloroplasts was 650 nm. The chloroplasts have been immobilised onto the sensor surface using cross-linking with glutaraldehyde and bovine serum albumin. The developed system allowed reliable detection of herbicides (RSD = 10%) with a detection limit of 1-8 nM depending on the type of herbicide. The sensor can be stored for 3 months at -80 oC. Preliminary measurements of river water samples using this sensor were also performed indicating good correlation between the data obtained with GC-MS and the chloroplast-based biosensor developed in this study.

Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη ενός αμπερομετρικού αισθητήρα για την ανίχνευση υπεροξειδίου του υδρογόνου και την ενσωμάτωσή του με χλωροπλάστες από σπανάκι γιατην περαιτέρω ανάπτυξη ενός αισθητήρα για ζιζανιοκτόνα. Ο αισθητήρας σχεδιάστηκε με τη χρήση ηλεκτροδίων μεταξοτυπίας που παράγονται εύκολα στις εγκαταστάσεις που είναι διαθέσιμες στο Πανεπιστήμιο του Cranfield. Ο αισθητήρας υπεροξειδίου του υδρογόνου έχει βασιστεί στην υπεροξειδάση χρένου (HRP) ως καταλυτικό στοιχείο και στην υδροκινόνη ως μεσολαβητή. Η HRP ακινητοποιήθηκε στην επιφάνεια του αισθητήρα χρησιμοποιώντας ένα πρόσφατα αναπτυγμένο πολυμερές με βάση τη θειοακετάλη ικανό για ομοιοπολική ακινητοποίηση πρωτοταγών αμινών. Ένας νέος βιοαισθητήρας βασισμένος σε HRP αναπτύχθηκε με μεταξοτυπία χρησιμοποιώντας μείγμα άνθρακα/πολυμερούς. Οι συγκεντρώσεις υπεροξειδίου του υδρογόνου αναλύθηκαν στο δυναμικό αναγωγής της υδροκινόνης (-0,3 V). Οι βιοαισθητήρες που αναπτύχθηκαν σε αυτή την εργασία είχαν χαμηλό όριο ανίχνευσης H2O2 (0,1 μM), μακροχρόνια σταθερότητα (μπορούν να αποθηκευτούν για 2 μήνες στους 4 oC) και με καλή αναπαραγωγιμότητα των μετρήσεων (RSD ~ 5%).Στον αισθητήρα υπεροξειδίου του υδρογόνου ενσωματώθηκαν χλωροπλάστες από σπανάκι σε μια προσπάθεια να δημιουργηθεί ένας αισθητήρας για ζιζανιοκτόνα ικανά να αναστέλλουν τη φωτοσύνθεση. Διαπιστώθηκε ωστόσο ότι η ποσότητα του H2O2 που παράγεται από τους χλωροπλάστες στις πειραματικές μας συνθήκες δεν ήταν επαρκής για να επιτρέψει την ποσοτική ανάλυση των ζιζανιοκτόνων υπό μελέτη. Λόγω αυτού, αναπτύχθηκε μια εναλλακτική προσέγγιση που βασίζεται στην ηλεκτροχημεία της αντίδρασης Hill. Σε αυτή την αντίδραση η φωτοσυνθετική διαδικασία και η ροή ηλεκτρονίων που διέρχεται από το φωτοσύστημα II (PSII) παρακολουθείται μέσω της ποσότητας του μειωμένου τεχνητού δέκτη ηλεκτρονίων. Κατά τονφωτισμό των χλωροπλαστών καταγράφηκε χρονοαμπερομετρικά το σήμα από τον μειωμένο δέκτη ή μεσολαβητή. Το προστιθέμενο ζιζανιοκτόνο αναστέλλει τη φωτοσυνθετική διαδικασία και μειώνει το σήμα του μεσολαβητή. Η μείωση του μετρούμενου ρεύματος είναι ανάλογη με τις συγκεντρώσεις ζιζανιοκτόνου και έτσι η μείωση αυτή χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του εκάστωτε ζιζανιοκτόνου. Τρεις μεσολαβητές της αντίδρασης Hill δοκιμάστηκαν, συμπεριλαμβανομένων 2,6 διχλωροφαινολινδροφαινόλης (DCPIP) ντουροκινόνης και σιδηροκυανιούχου καλίου. Τα βέλτιστα αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας DCPIP. Το βέλτιστο μήκος κύματος για τη διέγερση των χλωροπλαστών ήταν στα 650 nm. Οι χλωροπλάστες είχαν ακινητοποιηθεί στην επιφάνεια του αισθητήρα χρησιμοποιώντας διασταυρούμενη σύνδεση με γλουταραλδεΰδη και αλβουμίνη βόειου ορού. Το ανεπτυγμένο σύστημα επέτρεψε αξιόπιστη ανίχνευση ζιζανιοκτόνων (RSD = 10%) με όριο ανίχνευσης 1-8 nM ανάλογα με τον τύπο του ζιζανιοκτόνου. Ο αισθητήρας μπορεί να αποθηκευτεί για 3 μήνες στους -80 oC. Πραγματοποιήθηκαν επίσης προκαταρκτικές μετρήσεις δειγμάτων νερού από ποτάμι χρησιμοποιώντας τον αισθητήρα αυτό, υποδεικνύοντας καλή συσχέτιση μεταξύ των δεδομένων που ελήφθησαν με τον αναλυτή αέριας χρωματογραφία-φασματοσκοπίας μάζας (GC-MS) και του βιοαισθητήρα που αναπτύχθηκε σε αυτή τη μελέτη και που βασίζεται σε μετρήσεις μέσω χλωροπλαστών.

Φυσικές Επιστήμες ➨ Γεωεπιστήμες και Επιστήμες Περιβάλλοντος ➨ Περιβαλλοντική χημεία

Aquatic environment

Ηλεκτροχημεία

Βιοαισθητήρες

Electrochemistry

Περιβαλλοντική χημεία

Περιβάλλον

Natural Sciences

Biosensors

Φυσικές Επιστήμες

Environmental Chemistry

Γεωεπιστήμες και Επιστήμες Περιβάλλοντος

Earth and Related Environmental Sciences

Αγγλική γλώσσα

Institutes outside Greece

Ιδρύματα Εξωτερικού

Cranfield university

Εθνικό Κέντρο Τεκμηρίωσης και Ηλεκτρονικού Περιεχομένου (ΕΚΤ)

Εθνικό Αρχείο Διδακτορικών Διατριβών

Συλλογή ΕΑΔΔ