The aim of this project was the study of neutrophil recruitment and reverse transmigration using murine and human in vitro models of inflammation. Murine in vitro models of inflammation were developed using an immortalised microvascular cell line (MCEC-1) and primary murine vascular endothelial cells (mEC) isolated from heart and lung. We found that MCEC-1 could recruit murine neutrophils without the requirement of cytokine stimulation, although efficient transmigration did require such a stimulus. Primary cells (mEC) required cytokine stimulation to recruit neutrophils. Interestingly, and in contrast to human EC, mEC were relatively insensitive to TNF-α stimulation, although IL-1β was a good stimulus for adhesion and migration. We used IL-1β to generate murine reverse migrated neutrophils (mRPMN) and their phenotype and prolonged survival were assessed. Using adoptive transfer strategies, we investigated the fate of mRPMNs in vivo. Additionally, the effect of shear stress and nitric oxide on the regulation of the process of reverse migration was examined in human in vitro models of inflammation. A significant part of this work involved the study of human reverse migrated neutrophils (RPMN) at a proteomic level using two-Dimensional Fluorescence Gel Electrophoresis methodology to identify changes in neutrophils associated with reverse migration process. We found that murine reverse migrated neutrophils had a very similar surface phenotype to human reverse migrated cells. They also showed prolonged survival. However, our preliminary data on trafficking in vivo did not give a clear indication about their fate upon adoptive transfer into recipient mice. In vitro studies showed that flow generated shear stress and nitric oxide delayed, but did not inhibit, the process of reverse migration. Finally, the proteomics study revealed a number of metabolic, cytoskeletal and regulatory proteins that were differentially expressed in human reverse migrated neutrophils although the functional significance of these changes is yet to be explored.
Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της στρατολόγησης και της αντίστροφης μετανάστευσης ουδετερόφιλων, με χρήση in vitro μοντέλων φλεγμονής από κύτταρα ποντικού και ανθρώπου. Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκαν in vitro μοντέλα φλεγμονής, χρησιμοποιώντας αρχικά μια αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά μικροαγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων ποντικού (MCEC-1) και στη συνέχεια πρωτογενή ενδοθηλιακά κύτταρα (mEC) απομονωμένα από την καρδιά και τον πνεύμονα ποντικών. Ανακαλύψαμε ότι τα MCEC-1 μπορούσαν να στρατολογήσουν ποντικίσια ουδετερόφιλα απουσία διέγερσης με κυτταροκίνες, αν και η αποτελεσματική μετανάστευση απαιτούσε ένα τέτοιο ερέθισμα. Τα πρωτογενή κύτταρα mEC απαιτούσαν διέγερση με κυτταροκίνες για να προσελκύσουν ουδετερόφιλα. Σε αντίθεση με τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (EC), τα mEC έδειξαν ελαττωμένη ευαισθησία σε διέγερση με TNF-α, συγκριτικά με την IL-1β, η οποία μπορούσε να επάγει αρκετά αποτελεσματικά την προσκόλληση και τη μετανάστευση των ουδετερόφιλων. Χρησιμοποιώντας IL-1β για την επαγωγή οξείας φλεγμονής στα in vitro μοντέλα, συλλέξαμε ποντικίσια ουδετερόφιλα που είχαν πραγματοποιήσει αντίστροφη μετανάστευση (mRPMN) και αξιολογήθηκε ο φαινότυπος και η παρατεταμένη επιβίωσή τους. Στη συνέχεια, με τη χρήση στρατηγικών μεταφοράς κυττάρων ερευνήσαμε την τύχη των mRPMN in vivo. Παράλληλα, εξετάστηκε η επίδραση της διατμητικής τάσης και του μονοξειδίου του αζώτου στη ρύθμιση της διαδικασίας της αντίστροφης μετανάστευσης των ουδετερόφιλων με τη χρήση ενός in vitro μοντέλου φλεγμονής από ανθρώπινα κύτταρα. Ένα σημαντικό μέρος αυτής της εργασίας περιλάμβανε τη μελέτη των ανθρώπινων ουδετερόφιλων που είχαν πραγματοποιήσει αντίστροφη μετανάστευση (RPMN), σε πρωτεομικό επίπεδο με μεθοδολογία ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων για τον εντοπισμό αλλαγών στα ουδετερόφιλα που σχετίζονται με τη διαδικασία αντίστροφης μετανάστευσης. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι τα ποντικίσια mRPMN είχαν παρόμοιο φαινότυπο με τα ανθρώπινα RPMN όσον αφορά συγκεκριμένους επιφανειακούς δείκτες, ενώ έδειξαν επίσης παρατεταμένη επιβίωση. Ωστόσο, τα προκαταρκτικά μας δεδομένα, όσον αφορά την in vivo κατανομή τους, δεν έδωσαν σαφή ένδειξη σχετικά με την τελική τους τύχη μετά τη μεταφορά τους σε ποντίκια-αποδέκτες. Οι μελέτες στο in vitro μοντέλο φλεγμονής από ανθρώπινα κύτταρα έδειξαν ότι η παρουσία διατμητικής τάσης και το μονοξείδιο του αζώτου καθυστέρησαν, αλλά δεν ανέστειλαν, τη διαδικασία της αντίστροφης μετανάστευσης των ουδετερόφιλων. Τέλος, η πρωτεομική ανάλυση αποκάλυψε τη διαφορική έκφραση ενός αριθμού μεταβολικών, κυτταροσκελετικών και ρυθμιστικών πρωτεϊνών στα ανθρώπινα RPMN, αν και η λειτουργική σημασία αυτών των αλλαγών δεν έχει ακόμη διερευνηθεί.
National Documentation Centre (EKT)
