HURP (Hepatoma Up Regulated Protein) is a microtubule associated protein characterized for the first time in Hepatocellular Carcinoma and it has been strictly connected with cancer. HURP has an N-terminal nuclear localization signal (NLS), and is transferred in the nucleus through importin-β. Once inside the nucleus, HURP is released by Ran-GTP in the proximity of the chromosomes, where it has a role during mitosis. In metaphase HURP is localized predominantly on kinetochore microtubules with higher concentration in the vicinity of chromosomes. Particularly, HURP not only binds and stabilizes the microtubules (MTs), but also promotes their nucleation around the chromosomes, at the kinetochores. HURP's expression is time and tissue specific. Moreover, HURP has a role in a chromatin-dependent pathway responsible for the assembly of the mitotic spindle, and is a component of a complex (as shown in Xenopus egg extracts) with the proteins Aurora A, TPX2, XMAP215 and Eg5. Aurora A phosphorylates HURP and promotes its function and anchorages HURP on the microtubules. The role of this complex is to change the aster-like function of the microtubules to spindle-like function. A similar complex in mammal cells is not yet determined. The purpose of the thesis was to analyze the association of taxol resistance with HURP expression in breast cancer. For this particular reason, our lab employed a multistage human breast carcinogenesis model, consisted of the human breast cancer cell lines: MCF-7, T47D, MDA MB-435S. Paclitaxel (taxol) is an anti-cancer drug, which binds β-tubulin, preventing the depolymerization of microtubules. As a result, cells undergo apoptosis or they slip back to the G-phase of the cell cycle without division. WST-1 proliferation assay was used after 48 hours of taxol treatment in order to investigate the cell lines’ resistance to various concentrations of the drug. Western blot analysis was performed in order to determine the expression levels of HURP for each cell line. We observed that as the expression levels of HURP in the MDA MB-435S, T47D, MCF7 cell lines increased, the resistance of the cell lines to taxol was reduced. The aggressive metastatic cell line MDA MB-435S exhibits higher expression levels of HURP than the other two cell lines and the lowest taxol resistance. Subsequently, T47D exhibit lower levels of protein expression and higher taxol resistance. Finally, in MCF7 the concentration of HURP is even lower and the drug resistance even higher. An increased fluorescence is observed in the vicinity of chromosomes for T47D and MCF7, while for MDA 435S, where HURP is overexpressed, an unexpected localization in the cytoplasm around the spindle is observed. This indicated that HURP’s implication in taxol resistance may have a different effect on microtubules, through different cancer types.
Βιβλιογραφία : σ. 76-79
79 σ.
Η πρωτεΐνη HURP (Hepatoma Up Regulated Protein) είναι μια σχετικά πρόσφατα χαρακτηρισμένη πρωτεΐνη. Ανήκει στην oικoγένεια των MAPs (Microtubule Associated Proteins) πρωτεϊνών και χαρακτηρίστηκε για πρώτη φορά στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), από το οποίο προέρχεται και το όνομά της. Η HURP διαθέτει ένα σήμα πυρηνικού εντοπισμού στο αμινοτελικό της άκρο (NLS), μέσω του οποίου προσδένεται στην ιμπορτίνη-β και το σύμπλοκο εισέρχεται στον πυρήνα. Εκεί, απελευθερώνεται μέσω της Ran- GTP κοντά στα χρωμοσώματα, όπου επιτελεί τις λειτουργίες της κατά τη διάρκεια της μίτωσης. Σε αυτές περιλαμβάνονται η σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων (MT) μέσω πρόσδεσης και η επαγωγή του πολυμερισμού αυτών που εμπυρηνώνονται από τους κινητοχώρους. Η έκφρασή της είναι χρονοειδική και ιστοειδική. Επιπλέον, η HURP αποτελεί συστατικό ενός εξαρτώμενου από τη χρωματίνη μονοπατιού συγκρότησης της μιτωτικής ατράκτου και έχει αποδειχθεί μέσω πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν σε εκχυλίσματα αυγών Xenopus laevis πως λειτουργεί ως μέλος ενός σύμπλοκο που αποτελείται από ακόμη 2 MAPs την TPX2 και την XMAP215, την κινάση Aurora A και μια κινεσίνη την Eg5. Φωσφορυλιώνεται από την μιτωτική κινάση σερίνης/θρεονίνης Aurora A στο καρβοξυτελικό της άκρο και έχει προταθεί ότι αυτό οδηγεί στην απελευθέρωση του αμινοτελικού της άκρου και την πρόσδεσή του στους μικροσωληνίσκους. Το σύμπλοκο αυτό, διευθετεί τους μικροσωληνίσκους από τη δομή αστέρα (aster like) σε δομή ατράκτου (spindle like) ,ενώ στα θηλαστικά δεν έχει ακόμη επιβεβαιωθεί η ύπαρξή του. Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματεύεται την μελέτη συσχέτισης των βασικών επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης HURP σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού με την ανθεκτικότητα που παρούσιαζουν οι σειρές αυτές στο αντικαρκινικό φάρμακο ταξόλη (Taxol). Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν από το εργαστήριο μας οι ακόλουθες καρκινικές σειρές μαστού: MCF-7, T47D, MDA MB-435S οι οποίες προέρχονται από διαφορετικά στάδια καρκινογένεσης, μέσω χημικής μεταλλαξιγένεσης. Η ταξόλη ανήκει στην κατηγορία των αντικαρκινικών φαρμάκων που στοχεύουν τους μικροσωληνίσκους. Συγκερκιμένα, η δράση της χαρακτηρίζεται από την δυνατότητα πρόσδεσης στην εσωτερική επιφάνεια των μικροσωληνίσκων, στα μονομερή β-τουμπουλίνης, επάγοντας την σταθεροποίηση και αποτρέποντας τον αποπολυμερισμό των μικροσωληνίσκων. Τελικά, τα κύτταρα αδυνατούν να ολοκληρώσουν την μίτωση και είτε οδηγούνται σε απόπτωση, είτε επιστρέφουν και σταματούν στη G2 φάση. Αρχικά μελετήθηκε η ανθεκτικότητα των συγκεκριμένων κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού σε διαφορετικές τιμές συγκεντρώσεων του φαρμάκου με την χρωματομετρική μέθοδο του τετραζολικού άλατος WST-1 μετά από επίδραση της ταξόλη για 48 ώρες. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ημιποσοτικός προσδιορισμός των βασικών επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης HURP σε κχυλίσματα που λάβαμε από τις καρκινικές σειρές του μαστού, με ανάλυση κατά Western blot. Τα αποτελέσματα που λάβαμε έδειξαν ότι όσο αυξάνεται η συγκέντρωση της πρωτεΐνης HURP στις κυτταρικές σειρές MDA MB-435S, T47D, MCF7, μειώνεται η ανθεκτικότητα τους στο taxol. Στην επιθετική μεταστατική σειρά MDA MB-435S, τα επίπεδα έκφρασης της HURP είναι υψηλότερα σε σχέση με τις άλλες 2 κυτταρικές σειρές και παρουσιάζεται η χαμηλότερη ανθεκτικότητα στο taxol. Ακολούθως η T47D εμφανίζει χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης και υψηλότερη ανθεκτικότητα στο taxol. Τέλος στην MCF7 η συγκέντρωση της HURP είναι ακόμα χαμηλότερη και η ανθεκτικότητα στο φάρμακο ακόμη πιο υψηλή. Επιπλέον πειράματα ανοσοφθορισμού έδειξαν πως η HURP στη μεταστατική σειρά MDA MB-435S λόγω της υπερέκφρασής της, δεν εντοπίζεται μόνο στους μικροσωληνίσκους της μιτωτικής ατράκτου κατά την μίτωτική διαίρεση, αλλά βρίσκεται και στο κυτταρόπλασμα γύρω από την άτρακτο. Ίσως η HURP να έχει ένα πιο κρίσιμο ρόλο στον μηχανισμό λειτουργίας του taxol λόγω της ιδιαιτερότητάς της να σταθεροποιεί τους μικροσωλινίσκους της μιτωτικής ατράκτου, που όμως διαφέρει ανάμεσα στους καρκινικούς τύπους.
Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης
