102 σ.
Βιβλιογραφία: σ. 92-102
The use of antimicrobial drugs to treat human infections plays an important role in maintaining human health. The same is true for the administration of antimicrobials to farm animals for therapeutic purposes. However, on the contrary, there are phenomena of development of resistance in microbes that can be transmitted to humans through the food chain and lead to failure of therapeutic treatment, a fact that worries us worldwide. Resistance of Gram-negative bacteria to β-lactams is mainly due to enzymatic inactivation of the antimicrobial agent by hydrolysis β-lactamases including extended-spectrum β-lactamases (ESBLs). ESBLs were first observed in the 1980s and have since spread worldwide. These are enzymes with high hydrolytic activity that include many different types of extended-spectrum β-lactams. The most common types are CTX-M, TEM, SHV, and OXA, which are encoded by the corresponding bla genes on plasmids. The aim of this work was to isolate Escherichia coli strains resistant to cephalosporines from samples of pork and beef sold in butcher shops in the prefectures of Thessaloniki and Karditsa. The study included 66 pork and beef samples from 33 butcher shops from two different regions of our country. The suspected ESBL-E. coli strains were phenotypically confirmed by double diffusion plate synergy assay and tested for resistance to 18 antimicrobial agents using the disc diffusion method. At the same time, polymerase chain reaction (PCR) was used to identify ESBL-carrying genes (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA), while Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) was used to determine if the isolated strains were genetically related. Moreover, the positive strains were tested for their ability to form biofilms.
Of the total 66 samples tested, three strains (4.5%) tested positive for ESBL production. Two of these were isolated from the 45 pork samples (4.4%) and one from the 21 beef samples (4.8%). All three positive strains were isolated from meat of Greek origin, two were from butchers’ shops in Thessaloniki and one from a butcher shop in Karditsa. The highest resistance rates (100%) were observed for ampicillin, cephalexin, cefoperazone, nalidixic acid, pipercillin, tetracycline, and sulfamethoxazole with or without trimethoprim. Two of the three strains showed resistance to ciprofloxacin and the other to enrofloxacin, while one strain showed resistance to gentamicin. All strains were sensitive to ceftriaxone. ESBLs genes of the CTX-M-1 (coding genes 1,3 and 15) or CTX-M-9 (coding genes 9 and 14) group were detected in all three strains. The TEM-1 gene for broad-spectrum-β-lactamases was also detected in all strains. The three isolated strains were classified into three different pulsotypes based on PFGE, with no phylogenetic relationship demonstrated because their similarity rate was less than 40%. Two of the strains showed a strong capacity for biofilm production. The results of the present study show the presence of ESBL at levels similar to those reported by the European Food Safety Authority (EFSA) for European countries. The presence of ESBL-producing bacteria in the intestinal flora of humans, which are harmless as animals, may occur when resistant bacteria are spread from animals and food to humans. Bacteria from animals with such resistance should also be considered as a pool of resistance genes that can be transferred to other bacteria, including bacteria that cause food borne zoonotic diseases such as Salmonella spp. that have major Public Health impact.
Inadequate sanitation measures by meat processors and inadequate hygiene standards in meat outlets may lead to cross-contamination of meat with E. coli. This hypothesis is strengthened by the finding in our study that all three isolates have shown the ability to form biofilms.
Η χρήση αντιμικροβιακών φαρμάκων για τη θεραπεία λοιμώξεων του ανθρώπου παίζει καθοριστικό ρόλο στη διατήρηση της υγείας του. Το ίδιο συμβαίνει και με τη χορήγηση αντιμικροβιακών στα παραγωγικά ζώα για θεραπευτικούς σκοπούς. Στον αντίποδα, όμως, έχει οδηγήσει σε φαινόμενα ανάπτυξης αντοχής των μικροβίων, η οποία μπορεί να μεταφερθεί μέσω της τροφικής αλυσίδας στον άνθρωπο και να οδηγήσει σε αποτυχία της θεραπευτικής αγωγής γεγονός που προκαλεί στις μέρες μας παγκόσμια ανησυχία. Η αντοχή των Gram-αρνητικών βακτηρίων στις β- λακτάμες οφείλεται κυρίως στην ενζυμική αδρανοποίηση του αντιμικροβιακού μέσω υδρόλυσης που καταλύεται από ένζυμα όπως είναι οι εκτεταμένου φάσματος β-λακταμάσες (ESBLs). Οι ESBLs παρατηρήθηκαν πρώτη φορά τη δεκαετία του ’80 και έκτοτε η διασπορά τους είναι παγκόσμια. Πρόκειται για ένζυμα με μεγάλη υδρολυτική δράση που περιλαμβάνουν πολλούς τύπους β-λακταμασών εκτεταμένου φάσματος. Οι συνηθέστεροι τύποι είναι οι CTX-M, TEM, SHV και OXA που κωδικοποιούνται από τα αντίστοιχα bla γονίδια που εδράζονται κυρίως σε πλασμίδια. Ο σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η απομόνωση στελεχών Escherichia coli ανθεκτικών σε κεφαλοσπορίνες από δείγματα χοιρινού και βόειου κρέατος το οποίο πωλείται σε κρεοπωλεία των περιφερειακών ενοτήτων Θεσσαλονίκης και Καρδίτσας. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 66 δείγματα χοιρινού και βόειου κρέατος από 33 κρεοπωλεία από δύο διαφορετικές περιοχές της χώρας μας. Οι ύποπτες ESBL-E. coli επιβεβαιώθηκαν φαινοτυπικά με βάση τη δοκιμασία συνέργειας με δίσκους διπλής διάχυσης και εξετάστηκαν για την αντοχή τους σε 18 αντιμικροβιακές ουσίες με τη μέθοδο διάχυσης δισκίων αντιβιοτικών σε άγαρ. Παράλληλα, εφαρμόστηκε η δοκιμασία της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) για την ταυτοποίηση των γονιδίων που έφεραν ESBL (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA) ενώ εφαρμόστηκε η ηλεκτροφόρηση γέλης σε εναλλασσόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) για τον προσδιορισμό της κλωνικότητας των στελεχών που απομονώθηκαν. Τέλος, τα θετικά στελέχη εξετάστηκαν για την ικανότητα παραγωγής βιομεμβρανών.Από τα 66 συνολικά δείγματα που ελέγχθηκαν, τρία στελέχη (4,5%) έδωσαν θετικό τεστ παραγωγής ESBL. Δύο από αυτά απομονώθηκαν από τα 45 δείγματα χοίρειου κρέατος (4,4%) και ένα από τα 21 δείγματα βόειου κρέατος (4,8%). Και τα τρία θετικά στελέχη απομονώθηκαν από κρέας Ελληνικής προέλευσης, τα δύο προέρχονταν από κρεοπωλεία της ΠΕ Θεσσαλονίκης και το ένα από κρεοπωλείο της ΠΕ Καρδίτσας. Τα υψηλότερα ποσοστά αντοχής (100%) παρατηρήθηκαν σε αμπικιλλίνη, κεφαλεξίνη, κεφοπεραζόνη, ναλιδιξικό οξύ, πιπερσιλίνη,τετρακυκλίνη και σουλφαμεθοξαζόλη με ή χωρίς τριμεθοπρίμη. Δύο από τα τρία στελέχη παρουσίασαν αντοχή στη σιπροφλοξασίνη και το άλλο στην ενροφλοξασίνη, ενώ ένα στέλεχος έδειξε αντοχή στη γενταμυκίνη. Όλα τα στελέχη ήταν ευαίσθητα στην κεφτριαξόνη. Και στα τρία στελέχη ανιχνεύθηκαν τα γονίδια ESBLs της ομάδας CTX-M-1 (που κωδικοποιούν τα γονίδια 1,3 και 15) ή CTX-M-9 ( που κωδικοποιούν τα γονίδια 9 και 14). Επίσης σε όλα τα στελέχη ανιχνεύθηκε το γονίδιο ΤΕΜ-1. Τα τρία στελέχη που απομονώθηκαν κατατάχθηκαν σε τρεις διαφορετικούς παλσότυπους με βάση την PFGE χωρίς να παρουσιάζουν φυλογενετική συγγένεια αφού το ποσοστό ομοιότητάς τους ήταν μικρότερο του 40%. Τέλος, δύο από τα στελέχη έδειξαν ισχυρή ικανότητα παραγωγής βιομεμβράνης. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης, καταδεικνύουν την παρουσία ESBL στελεχών σε παρόμοια επίπεδα με αυτά που αναφέρει η Ευρωπαϊκή Αρχή για την Ασφάλεια των Τροφίμων (European Food Safety Authority) για τις Ευρωπαϊκές χώρες. Η εμφάνιση βακτηρίων που παράγουν ESBL στην εντερική χλωρίδα των ζώων είναι επικίνδυνη καθώς μπορεί να οδηγήσει στη διάδοση ανθεκτικών βακτηρίων από τα ζώα και τα τρόφιμα στον άνθρωπο. Τα βακτήρια από ζώα με τέτοια αντοχή θα πρέπει επίσης να θεωρούνται ως δεξαμενή γονιδίων αντοχής τα οποία μπορεί να μεταφερθούν σε άλλα βακτήρια, συμπεριλαμβανομένων των βακτηρίων που προκαλούν τροφιμογενείς ζωοανθρωπονόσους, όπως π.χ Salmonella spp., προκαλώντας συνέπειες στη Δημόσια Υγεία.
Οι ανεπαρκείς διαδικασίες υγιεινής των χειριστών κρέατος και τα ανεπαρκή πρότυπα υγιεινής στα καταστήματα λιανικής πώλησης κρέατος μπορεί να οδηγήσουν σε διασταυρούμενη μόλυνση του κρέατος με E. coli. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται από το εύρημα της έρευνάς μας πως και τα τρία απομονωμένα στελέχη έδειξαν πως είναι ικανά για την παραγωγή βιομεμβρανών
Democritus University of Thrace
