Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν αφενός μεν η αξιολόγηση της εφαρμογής δύο (2) μοριακών τεχνικών στη διάγνωση της οξείας βρουκέλλωσης, της PCR-ενζυμοσυνδετικής-ανοσολογικής μεθοδολογίας (PCR-ELISA) και της Real Time PCR (RT-PCR), αφετέρου δε η παρακολούθηση με τη μέθοδο της RT-PCR του βακτηριακού DNA, πριν και μετά τη θεραπεία και η πιθανή συσχέτιση του με την έκβαση και πορεία της νόσου. Όσον αφορά την εφαρμογή της PCR-ELISA, εξετάσθηκαν δείγματα ολικού αίματος και ορού από 243 ασθενείς. Μετά την αντίδραση πολλαπλασιασμού ενός τμήματος με 223 ζεύγη βάσεων του γονιδίου που κωδικοποιεί για τη σύνθεση μιας ανοσογόνου μεμβρανικής πρωτεΐνης μεγέθους 31 kDa (BCSP31), ειδικής για το γένος της Brucella με τη χρήση ειδικών εκκινητών, ακολουθούσε το στάδιο ανίχνευσης. Κατά το στάδιο αυτό το προϊόν πολλαπλασιαμού ανιχνευόταν μετά από υβριδισμό σε μικροπλάκα με τη βοήθεια ειδικού ιχνηθέτη σημασμένου με βιοτίνη (biotinylated probe). Για την αξιολόγηση της ποσοτικής RT PCR μεθοδολογίας στη διάγνωση της βρουκέλλωσης, εξετάσθηκαν δείγματα ολικού αίματος και ορού από 126 ασθενείς με διάγνωση οξείας νόσου. Από αυτούς για την παρακολούθηση του βακτηριακού DNA, εξετάσθηκαν από έναν υποπληθυσμό 78 ασθενών τουλάχιστον 3 δείγματα ολικού αίματος. Η αντίδραση πολλαπλασιασμού ενός τμήματος με 207 ζεύγη βάσεων του γονιδίου που κωδικοποιεί για τη σύνθεση της ίδιας μεμβρανικής πρωτεΐνης (BCSP31) και η ανίχνευση του προϊόντος πολλαπλασιασμού με την χρησιμοποίηση της φθορίζουσας τεχνικής των hybridization probes γινόταν ταυτόχρονα στο ίδιο τριχοειδές σωληνάριο ειδικού θερμικού κυκλοποιητή (LightCycler). To στάδιο πολλαπλασιασμού ακολουθούνταν από μελέτη της καμπύλης τήξης του προϊόντος (melting curve analysis) που επέτρεπε και ποιοτική ανάλυση για τον έλεγχο της ειδικότητας του πολλαπλασιασμένου γενετικού υλικού. Διακόσιοι σαράντα ένας από τους 243 ασθενείς που μελετήθηκαν με την PCR-ELISA είχαν ανιχνεύσιμο DNA Brucella, είτε στα δείγματα ολικού αίματος, είτε στα δείγματα ορού : σε 149 (61,3%) ασθενείς ανιχνεύθηκε DNA και στα δύο είδη δειγμάτων, σε 43 (17,7%) μόνο στα δείγματα ορού και σε 49 (20,2%) μόνο στα δείγματα ολικού αίματος. Η διαγνωστική ειδικότητα της μεθόδου και για τα δύο είδη δειγμάτων ήταν 100%, ενώ η ευαισθησία ήταν 81,5% για τα δείγματα ολικού αίματος, 79% για τα δείγματα ορού και 99,2% για το συνδυασμό των δειγμάτων. Στους 123 από τους 126 ασθενείς που μελετήθηκαν με την RT-PCR, ανιχνεύτηκε DNA Brucella είτε στο ολικό αίμα, είτε στον ορό είτε και στα δύο είδη δειγμάτων : σε 108 (85,7%) ασθενείς και στα δύο είδη δειγμάτων, σε 6 (4,8%) μόνο στα δείγματα ορού και σε 9 (7,1%) μόνο στα δείγματα ολικού αίματος. Η διαγνωστική ειδικότητα της μεθόδου και για τα δύο είδη κλινικών δειγμάτων ήταν 100%, ενώ η ευαισθησία ήταν 92,8% για τα δείγματα ολικού αίματος, 90,5% για τα δείγματα ορού και 97,6% για το συνδυασμό των δύο ειδών κλινικών δειγμάτων. Από τον υποπληθυσμό των 78 ασθενών, η πλειοψηφία (87% στο τέλος της θεραπείας, 77% στους 6 μήνες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας και 70% μετά το δεύτερο έτος από το τέλος της θεραπείας) είχαν επίμονα ανιχνεύσιμο βακτηριακό φορτίο, αν και ήταν ασυμπτωματικοί. Οι 6 ασθενείς που υποτροπίασαν, δεν είχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στο βακτηριακό τους φορτίο σε σχέση μ’ αυτούς που δεν υποτροπίασαν. Συμπερασματικά, η εφαρμογή των δύο μεθοδολογιών για την ανίχνευση του DNA της Brucella έδειξε ότι πρόκειται για ευαίσθητες και ειδικές μέθοδοι που μπορούν να βοηθήσουν στην έγκαιρη και έγκυρη διάγνωση της οξείας βρουκέλλωσης. Επιπλέον, η RT-PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση του βακτηριακού φορτίου και επομένως της πορείας της νόσου του ασθενή καθώς και την εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων για τη βελτίωση της θεραπευτικής προσέγγισης.
(EL)
The aim of this study was the evaluation of application two (2) molecular methods in diagnosis of acute brucellosis, polymerase chain reaction-enzyme immunoassay (PCR-EIA) and real time PCR (RT-PCR). RT-PCR was also used for monitoring bacterial DNA load before, during and after treatment in order to find a possible correlation with the outcome and course of the disease. Whole blood and serum specimens from 243 patients with acute brucellosis were examined by PCR-EIA. Following the amplification of a 223-bp sequence of a gene that codes for the synthesis of an immunogenic 31 kDa membrane protein specific for the Brucella genus (BCSP31), the amplified product was detected in a microtiter plate by hybridization with specific biotinylated probe. For the evaluation of a quantitative RT PCR assay, whole blood and serum specimen from 126 patients with acute brucellosis were examined. The evolution of bacterial DNA load was then monitored in 78 from these patients with at least 3 whole blood specimens. The RT PCR assay was based on direct amplification of a 207-base pair DNA sequence of the same membranic protein (BCSP31). The amplification product was detected by using the hybridization probes fluorescence technique. The amplification reaction and the detection of amplified product were performed at the same glass capillary of thermal cycler (LightCycler). After amplification, melting curve analysis was performed to verify the specificity of PCR products. Two hundred forty-one of the 243 patients, who were studied with PCR-EIA, had detectable Brucella DNA in either whole blood or serum specimens: 149 (61.3%) patients were positive in both blood and serum specimens, 43 (17.7%) were positive in serum specimens only, and 49 (20.2) were positive in whole blood specimens only. The diagnostic specificity of the PCR-EIA assay for both specimen categories was 100%, while the sensitivity was 81.5% for whole blood specimens, 79% for serum specimens, and 99.2% for whole blood and serum specimens combined. One hundred twenty-six of the 126 patients, who were studied with PCR-EIA, had detectable Brucella DNA in either whole blood or serum specimens: 108 (85.7%) patients were positive in both blood and serum specimens, 6(4.8%) were positive in serum specimens only, and 9 (7.1%) were positive in whole blood specimens only. The diagnostic specificity of the RT PCR assay for both specimen categories was 100%, while the sensitivity was 92.8% for whole blood specimens, 90.5% for serum specimens, and 97.6% for whole blood and serum specimens combined. The majority of 78 patients (87% at the end of treatment, 77% at 6 months after treatment completion, and 70% at >2 years after treatment) exhibited persistent detectable microbiological load despite being asymptomatic. The 6 patients who experienced relapse did not exhibit any statistically significant difference in their bacterial load at any stage of disease or during follow-up. In conclusion, the application of two assays for the detection of Brucella DNA showed that they are sensitive and specific methods which can assist the acurate rapid diagnosis of acute brucellosis efficiently. Moreover, RT PCR assay can be used for monitoring bacterial DNA load and, subsequently, the course of the disease in order to improve the clinical management of patients with brucellosis.
