1. Home page
  2. Search

Πρωτεϊνική μηχανική του ενζύμου L-ασπαραγινάση με στόχο την τροποποίηση της εκλεκτικότητάς του ως προς το υπόστρωμα

This item is provided by the institution :
Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών   

Repository :
Ψηφιακό Αποθετήριο Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών   

see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*



Πρωτεϊνική μηχανική του ενζύμου L-ασπαραγινάση με στόχο την τροποποίηση της εκλεκτικότητάς του ως προς το υπόστρωμα
Κοντούρη, Κασσιανή
Λάμπρου, Νικόλαος
Μεταπτυχιακή εργασία
2013-10-08
Το ένζυμο L-ασπαραγινάση καταλύει την μετατροπή της L-ασπαραγίνης σε Lασπαραγινικό οξύ και αμμωνία. Η ενδοφλέβια χορήγηση του ενζύμου, που έχει απομονωθεί από το βακτήριο E.coli, έχει αποδειχθεί πολύ αποτελεσματική στη χημειοθεραπεία κατά της οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η ανάπτυξη μιας ολοκληρωμένης μεθόδου έκφρασης και καθαρισμού του ανασυνδυασμένου ενζύμου σε κύτταρα E.coli και η δημιουργία τροποποιήσεων στο ένζυμο με μεθόδους πρωτεϊνικής μηχανικής, ώστε να προκύψουν νέες μορφές με τροποποιημένη εκλεκτικότητα ως προς το υπόστρωμα. Το ένζυμο κλωνοποιήθηκε σε E.coli και μελετήθηκε η έκφρασή του σε διαφορετικά στελέχη και διαφορετικά θρεπτικά μέσα με σκοπό τον προσδιορισμό των βέλτιστων συνθηκών που εξασφαλίζουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης. Αναπτύχθηκε βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο καθαρισμού του ανασυνδυασμένου ενζύμου με εφαρμογή χρωματογραφία ιοντοαναταλλαγής σε στήλη CM-Sepharose. Νέες μορφές L-ασπαραγινάσης σχεδιάστηκαν με βάση δομικές πληροφορίες χρησιμοποιώντας μοριακή μοντελοποίηση. Δομική ανάλυση έδειξε ότι το κατάλοιπο Asn24 συμβάλει στη διαμόρφωση της αρχιτεκτονικής του ενεργού κέντρου και επιλέχτηκε για περεταίρω μελέτη. Βιβλιοθήκη μεταλλαγμένων μορφών πραγματοποιήθηκε με κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση κορεσμού στη θέση 24 με τη μέθοδο της επικαλυπτόμενης επιμήκυνσης χρησιμοποιώντας την τεχνική της PCR. Οι νέες μορφές που απομονώθηκαν χαρακτηρίστηκαν κινητικά και διαπιστώθηκε ότι η θέση 24 συμβάλει σημαντικά στον καθορισμό και διαμόρφωση της εκλεκτικότητας του ενζύμου ως προς τα υποστρώματα L-ασπαραγίνη και L-γλουταμίνη.
L-asparaginase catalyzes the conversion of L-asparagine to L-aspartic acid and ammonia. The intravenous administration of the enzyme, isolated from the bacterium E. coli, has proved very effective in chemotherapy of acute lymphoblastic leukemia. The purpose of this study is to develop an integrated protocol for the expression and purification of the recombinant enzyme and to design and create mutant enzyme forms with altered substrate specificity. The expression of the enzyme was investigated in different E. coli strains and in different culture media to determine the optimal conditions for achieving higher expression levels. An optimized purification protocol was developed using a single chromatographic step on ion-exchange column CM-Sepharose. New mutant forms of the enzyme were designed using information from the crystal structure, employing molecular modeling. Structural analysis showed that Asn-24 contributes indirectly to active site architecture and was selected for further study. A library of mutant enzymes was constructed using PCR-based site-saturation mutagenesis at position 24. The library was screened using activity assays and new enzyme variants were isolated and characterized using kinetic analysis. The results showed that the position 24 contributes significant in determining the substrate specificity of the enzyme towards the substrates L-asparagine and L-glutamine.
Protein engineering
Θεραπευτική χρήση ενζύμων
Πρωτεϊνική μηχανική
Enzymes -- Therapeutic use
Asparaginase
L- ασπαραγινάση
Greek
ΓΠΑ Τμήμα Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας
Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Ψηφιακό Αποθετήριο Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών
Μεταπτυχιακές Διατριβές



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)