Το μονοπάτι διακυτταρικής σηματοδότησης μέσω του υποδοχέα Νotch (N) αποτελεί έναν εξελικτικά συντηρημένο μηχανισμό, ο οποίος ενεργοποιείται σε πλειάδα κυτταρικών αποφάσεων σε όλα τα μετάζωα. Τόσο ο ίδιος ο υποδοχέας Ν, όσο και οι δεσμευτές του Delta (Dl) και Serrate (Ser) είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες απλής διέλευσης. Η αλληλεπίδραση του εξωκυττάριου τμήματος του Ν με τους δεσμευτές του επάγει την πρωτεόλυση του υποδοχέα, η οποία απελευθερώνει το ενδοκυττάριο ενεργό τεμάχιό του (Nic). To Nic μεταναστεύει στον πυρήνα του κυττάρου-δέκτη, στρατολογείται στους υποκινητές και λειτουργεί ως μεταγραφικός συνενεργοποιητής για τα γονίδια-στόχους του μονοπατιού. Για να επιτευχθεί η ενεργοποίηση του μονοπατιού με ακρίβεια στα διάφορα κύτταρα, εκτός από μεταγραφική ρύθμιση, τα διάφορα συστατικά του μονοπατιού υπόκεινται και σε μετα-μεταφραστική ρύθμιση, όπως πρωτεόλυση, γλυκοζυλίωση και ουβικουϊτινυλίωση. Στη συγκεκριμένη εργασία μελετήθηκε στη Δροσόφιλα ο ρόλος των δεσμευτών του N, Dl και Ser και των Ε3 λιγασών ουβικουϊτίνης Neuralized (Neur) Mind Bomb1 (Mib1) στη σηματοδότηση. Στο πρώτο μέρος της εργασίας, μελετήθηκε το γονίδιο neur, το οποίο κωδικοποιεί μία Ε3 λιγάση ουβικουϊτίνης τύπου RING, αλλά ο ακριβής στόχος του κατά τη σηματοδότηση παρέμενε άγνωστος. Δείχθηκε ότι το Neur είναι μια μεμβρανική κυτταροπλασματική πρωτεΐνη, η οποία στοχεύει το Dl και προκαλεί την ενδοκύττωση και αποικοδόμησή του, με τρόπο που εξαρτάται από το μοτίβο RING. Σε μεταλλαγές απώλειας λειτουργίας του neur εμποδίζεται η ενδοκύττωση του Dl, ενώ σε εκτοπική έκφρασή του ενισχύεται η ενδοσωμική κατανομή του. Επιπλέον, το neur δρα μη αυτόνομα στη σηματοδότηση Ν (παίζει ρόλο στο κύτταρο που αποστέλλει το σήμα και όχι σε αυτό που το δέχεται) και ενισχύει τη σηματοδοτική ικανότητα του Dl. Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο ρόλος των δεσμευτών του Ν στην πλευρική αναστολή και δείχθηκε ότι το Dl και το Ser δρουν συνεργατικά κατά την διαδικασία του καθορισμού των μακροχαιτών (σε αντίθεση με την μέχρι τώρα πεποίθηση ότι μόνο το Dl είναι απαραίτητο) και η μεταγραφική τους ρύθμιση δεν είναι απαραίτητη. Επιπλέον, δείχθηκε ότι και οι δύο δεμευτές του Ν χρειάζονται Neur για να δράσουν και το τελευταίο έχει την ίδια επίδραση και στα δύο μόρια: αλληλεπιδρά φυσικά και με τους δύο και προκαλεί την ενδοκύττωσή τους. Επιπλέον, χαρακτηρίσαμε μία νέα Ε3 λιγάση ουβικουϊτίνης, την Mind bomb1 (Mib1) για τους δεσμευτές του Ν. Δείξαμε ότι οι δύο λιγάσες ουβικουϊτίνης Neur και Mib1 έχουν μερικώς πλεονάζουσα δράση στην πλευρική αναστολή. Στην επαγωγή του περιθωρίου του φτερού το Mib1 απαιτείται, επειδή το Neur δεν εκφράζεται παντού στο φτερό, αλλά μόνο στις προνευρικές περιοχές. Η ανάγκη για λιγάσες ουβικουϊτίνης μας οδηγεί σε ένα μοντέλο, στο οποίο η ουβικουϊτινυλίωση και η ενδοκύττωση των δεσμευτών του Ν απαιτείται για σηματοδότηση. Επίσης, στη συγκεκριμένη εργασία αναλύθηκε με μεγάλη λεπτομέρεια ο ρόλος του ελλειμματικού μορίου NeurΔR, από το οποίο απουσιάζει το RING μοτίβο, το οποίο είναι σημαντικό για τη δραστικότητα Ε3 λιγάσης. Το μόριο αυτό δεν έχει πάντοτε αρνητική δράση στη σηματοδότηση. Αντιθέτως, έχει την ικανότητα να προωθεί την αποστολή του σήματος, αλλά εμποδίζει τη λήψη του. Από τα παραπάνω μπορούμε να υποθέσουμε ότι το Neur μπορεί να έχει διπλό ρόλο, τόσο στην αποστολή, όσο και στη λήψη του σήματος (ελαττώνει τη cis-αρνητική δράση των δεσμευτών). Στην πρώτη του δράση (αποστολή), το NeurΔR συνεργάζεται με το Mib1, καθώς η αποστολή του σήματος αναστέλλεται πλήρως, όταν απουσιάζει το δεύτερο.
(EL)
The Notch signaling pathway constitutes an evolutionarily conserved mechanism, which is activated during a variety of cell fate decisions in all metazoans. It revolves around the singlepass transmembrane Notch (N) receptor and its also transmembrane ligands, Delta (Dl) and Serrate (Ser). Following interaction of the extracellular domain of the receptor with the ligands, a proteolytic step is triggered, which leads to the release of the active intracellular part of the N receptor (Nic). Nic then travels to the nucleus, where it acts as a transcriptional co-activator and in association with other DNA binding factors activates transcription of target genes. Apart from transcription factors, a variety of proteins control the precise activation of the pathway in time and space post-transcriptionally; these include proteases, glycosyl-transferases and E3 ubiquitin ligases. In this work, the role of N ligands, Dl and Ser, as well as their two associated ubiquitin ligases, Neuralized (Neur) and Mind bomb1 (Mib1) was studied in N pathway activation in Drosophila. The role of neur was studied first. Although the gene was cloned 25 years ago, the protein was characterized as a RING type E3 ubiquitin ligase only recently and its target remained unknown. We showed that Neur is a membrane associated intracellular protein, which targets the N ligand Dl for endocytosis and degradation in a RING dependent manner. In neur loss of function mutations, Dl endocytosis is blocked and the opposite is true when neur is ectopically expressed (increased endocytosis). Neur also enhances Dl signaling activity and acts nonautonomously (in the signal-emitting cell) during N signaling. Then, the role of the two N ligands was studied during the process of lateral inhibition and it was shown that contrary to prior belief, Dl and Ser act synergistically during this process (it was thought that Dl was the sole active ligand there), and their transcriptional regulation is not important for this function. Both Dl and Ser need Neur in order to have full function during lateral inhibition and Neur physically associates with Ser and enhances its endocytosis and degradation (similar to its effects on Dl). Furthermore, we characterized Mib1, another RING type E3 ubiquitin ligase, which we showed that exhibits a redundant function with Neur during lateral inhibition. During wing margin development, Mib1 is required, because Neur is not expressed there. In the absence of both neur and mib1 signaling is completely abolished, which points to a model in which ubiquitination and endocytosis of N ligands is a prerequisite for signaling. The role of a truncated NeurΔR molecule was also analyzed in detail. This lacks the active ubiquitin ligase domain and it was thought to exhibit a negative effect in signaling. We noticed that NeurΔR is active in signal sending, but is inactive in signal reception. It can also rescue the highly neurogenic phenotype of neur loss of function mutations in embryos and adult bristles. This leads us to interesting results concerning the function of the wild type Neur protein; Neur might have a dual function during N signaling: it can activate signal sending in a RING independent manner and it can also allow cells to receive the N signal in a RING dependent manner (e.g. by reducing the cis-negative effect of the high concentration of ligands). NeurΔR seems to functionally interact with Mib1 in order to exert its signal sending activity, because in the absence of mib1, signal sending is completely abolished.
(EN)
