Τεκμηρίωση και χαρακτηρισμός του ρυθμιστικού ρόλου του miR-13
Βρεττός, Νικόλαος
(EL)
Vrettos, Nikolaos
(EN)
Τα MicroRNAs είναι μικρά μονόκλωνα RNA μόρια, 22 νουκλεοτιδίων περίπου, που δύναται να συντονίζουν σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες σε ζώα και φυτά. Επιτελούν ρύθμιση στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Στοχεύουν mRNA και τα οδηγούν στο μονοπάτι παρεμπόδισης της πρωτεινοσύνθεσης ή σε αυτό της ενδονουκλεόλυσης (RNAi). Η υποοικογένεια των miRNAs K-box miR-2/miR-13 στη Drosophila περιέχει μέλη με υψηλή ομολογία και πιθανώς συγγενή λειτουργικό ρόλο. Το γονίδιο CG10222 είναι φορέας της αλληλουχίας K-box στο 3΄UTR του μέσω του οποίου δύναται να ρυθμίζεται αρνητικά από μέλη της υποοικογένειας miR-2/miR-13. Στην παρούσα εργασία κατασκευάστηκαν ετερόλογα πλασμίδια αισθητήρες που περιείχαν την κωδική περιοχή της EGFP ενωμένη με το 3΄UTR του γονιδίου CG10222 καθώς και με τροποποιημένες εκδόσεις του στην περιοχή του K-box. Οι τροποποιήσεις είχαν γίνει με τρόπο ώστε να αίρεται ή να υποβοηθάται η αλληλεπίδραση μεταξύ miRNA και mRNA. Όλα τα μετάγραφα βρίσκονταν υπό τον έλεγχο μεταγραφής ενός συστατικού υποκινητή τουμπουλίνης. Οι κατασκευές αυτές χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή σταθερών διαγονιδιακών σειρών Drosophila. Ακολούθησε η ανάλυση του φθορισμού της EGFP σε προνύμφες 3ου σταδίου και εμβρυϊκούς δίσκους φτερών. Το συμπέρασμα που εξάγεται είναι ότι το miR-13b είναι αρνητικός ρυθμιστής της έκφρασης του γονιδίου CG10222 μέσω της αλληλεπίδρασης με την περιοχή 11-24 νουκλεοτίδια μετά του κωδικού λήξης, στο 3΄UTR του μεταγράφου του. Επιπλέον φάνηκε ότι το miR-13b εκφράζεται σε όλα τα σωματικά μέρη της προνύμφης εκτός των αρσενικών γονάδων. Η λειτουργία του CG10222 είναι άγνωστη. Πειράματα εφαρμογής RNAi έναντί του σε έμβρυα Drosophila δείχνουν ότι επιτελεί κάποια ζωτικής σημασίας λειτουργία.. Ενδείξεις επίσης δημιουργούνται για πιθανή ιστοειδική έκφραση στους όρχεις.
(EL)
MicroRNAs are small single stranded RNA molecules, of about 22 nucleotides, that can regulate important cellular functions in animals and plants. They exert their regulatory role by targeting mRNAs for cleavage or translational impairment. Hence they are regulators of gene expression at the post-transcriptional level. The subfamily of K-box miR-2/miR-13 in Drosophila contains members with almost identical sequence, and consequently similar functional roles. The gene CG10222 carries a K-box motif at its 3΄UTR with which it is potentially down regulated by members of the K-box subfamily. During this project heterologous sensor plasmids were constructed containing fusions between EGFP protein and the wild type 3΄UTR of CG10222 as well as mutated versions of it. These mutations aimed either to weaken or reinforce the interaction between miRNA and mRNA. All transcripts were under the control of a constitutively active tubulin promoter. The sensor constructs were used for the generation of stable Drosophila transgenic lines. EGFP fluorescence analysis at 3rd instar larvae and wing imaginal discs was followed. It was concluded that indeed miR-13b is a negative regulator of CG10222. The region between 11-24 nucleotides after the stop codon at the 3΄UTR was found to be a regulatory element that interacts with miR-13b. Additionally, it was observed that miR-13b is present throughout the body of the larva except for the male gonads. CG10222 has an unidentified function. RNAi strategies against it show that it is indispensable for embryo physiology. Finally there is evidence for a testis specific expression.
(EN)
