H αθηρωμάτωση είναι η βασική αιτία για την εμφάνιση της καρδιαγγειακής νοσου (Κ.Ν.), στην οποία οφείλεται το 50% των θανάυων στο δυτικό κόσμο. Αρκετοί παράγοντες συμμετέχουν στην ανάπτυξη της αθηρωμάτωσης όπως η δυσλιπιδαιμία, η συσσώρευση λιπιδίων στα αρτηριακά τοιχώματα και η χρόνια φλεγμονή. Η υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (HDL) είναι ένας αθηροπροστατευτικός παράγοντας, επειδή ενεργοποιεί το μηχανισμό της αντιστροφης μεταφοράς χοληστερόλης από τα περιφερικά κύτταρα στό ήπαρ ενώ επίσης έχει αντι-φλεγμονώδεις και αντι-οξειδωτικές δράσεις. Τόσο οι πρωτεΐνες όσο και τα λιπίδια που βρίσκονται στην HDL καθορίζουν τις αθηροπροστατευτικές της δράσεις. Μη λειτουργική, προφλεγμονώδης HDL έχει παρατηρηθεί σε άτομα με στεφανιαία νόσο, αλλά και σε ασθενείς με χρόνια φλεγμονώδη νόσο όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα (ΡΑ) και ο συστημικός ερυθηματώδης λύκος (ΣΕΛ). Συνεπώς, στο πρώτο μέρος αυτής της εργασίας, μελετήσαμε τη σύγκεντρωση της HDL χοληστερόλης καθώς και τα επίπεδα των απολιποπρωτεϊνών Α-Ι και Μ στο πλάσμα ασθενών με ΣΕΛ και ΡΑ. Η απολιποπρωτεΐνη Μ είναι μια πρωτεΐνη που συνδέεται σε σωματίδια HDL με αθηροπροστατευτικές και αντι-οξειδωτικές ιδιότητες, ενώ η έκφραση της ελέγχεται αρνητικά από φλεγμονώδη ερεθίσματα, όπως ο TNFα. Με τη τεχνική Western blot, παρατηρήσαμε ότι τα επίπεδα της απολιποπρωεΐνης Μ μειώνονται στους ασθενείς σε σχέση με τους υγιείς σε ποσοστό 20-65%. Αντίθετα, τα επίπεδα της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι καθώς και τα επίπεδα της HDL χοληστερόλης παραμένουν ανεπηρέαστα στο πλάσμα των ασθενών σε σύγκριση με τους υγιείς. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η έλλειψη της απολιποπρωτεΐνης Μ απο την HDL σε ασθενείς με ΡΑ και ΣΕΛ μπορεί να οδηγεί στη παραγωγή ελλατωματικής HDL, με αποτέλεσμα η τελευταία να χάνει τις αθεροπροστατευτικές τις δράσεις οδηγώντας στην ανάπτυξη της αθηρωμάτωσης.
Ο LXRα είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην αθηροπροστασία, διότι αφενός ελέγχει τη ρύθμιση γονιδίων της HDL που συμμετέχουν στο μονοπάτι της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης και αφετέρου αναστέλλει την έκφραση προφλεγμονωδών γονιδίων στα μακροφάγα. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου του LXRα στα μακροφάγα, στα ηπαττοκύτταρα καθώς και σε άλλους κυτταρικούς τύπους δεν έχουν εξακριβωθεί πλήρως. Έτσι, στο δεύτερο μέρος αυτής της εργασίας επικεντρωθήκαμε στο πώς ρυθμίζεται ο υποκινητής του ανθρώπινου LXRα γονιδίου από φλεγμονώδες ή μεταβολικό ερέθισμα. Για να ανιχνεύσουμε ρυθμιστικά στοιχεία στον υποκινητή του ανθρώπινου LXRa γονιδίου που συμμετέχουν σε αυτές τις διαδικασίες,
6
πραγματοποιήσαμε παροδικές διαμολύνσεις σε ανθρώπινα κύτταρα ηπατοβλαστώματος (HepG2) και σε ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (HEK293) με πλασμίδια που φέρουν διαδοχικές ελλείψεις του υποκινητή του γονιδίου του LXRα και επίσης φέρουν το γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράση. Σε αυτές τις διαμολύνσεις υπερεκφράσαμε επιπλέον είτε τον TLR4 υποδοχέα, οποίος είναι ο φυσικός υποδοχέας του LPS (φλεγμονώδες ερέθισμα), είτε τον μεταγραφικό παράγοντα HNF4 (μεταβολικό ερέθισμα). Παρατηρήσαμε ότι υπερέκφραση του TLR4 ανέστειλλε την ενεργότητα του υποκινητή του γονιδίου του LXRα μέσω της ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB, με εναν μηχανισμό ανεξάρτητου από τον IKKβ. Αντίθετα, η υπερέκφραση του HNF4 αύξησε την ενεργότητα του υποκινητή του γονιδίου LXRα μέσω της περιοχής -111/ -42 του υποκινητή, πτοτείνοντας μια ανταγωνιστική δράση μεταξύ του NF-κΒ και του HNF4 για τη ρύθμιση του γονδίου του LXRa στα ηπατοκύτταρα.
(EL)
3
Abstract
Atherosclerosis is the underlying cause of cardiovascular disease (CVD) which accounts for 50% of deaths in the western world. Various factors contribute to the development of atherosclerosis including dyslipidemia, lipid accumulation on the artery wall and chronic inflammation. High density lipoprotein (HDL) is a known atheroprotective factor, since it stimulates the reverse cholesterol transport RCT) and it also exerts both anti-inflammatory and anti-oxidative properties. Both proteins and lipds of HDL determine its atheroprotective functions. Dysfunctional, proinflammatory HDL, has been reported in patients with coronary artery disease (CAD), as well as in patients with chronic inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis (RA) and systemic lupus erythematosus (SLE). Therefore, in Part I of this thesis we examined the concentration of HDL and the plasma levels of apolipoproteins A-I and M in patients with SLE or RA. ApoM is a novel HDL binding protein with atheroprotective and anti-oxidative properties, which is downregulated by inflammatory stimuli such as tumor necrosis factor a (TNFα). We performed western blot analysis in serum from healthy controls and from patients with SLE or RA and we observed that apoM levels were decreased by approximately 20-65% in patients, while both HDL cholesterol and apolipoprotein A-I (apoA-I) levels remained unchanged. These findings suggest that the lack of apoM in HDL from RA and SLE patients could cause HDL dysfunction and loss of atheroprotection thus leading to accelerated atherosclerosis.
Liver X receptor α (LXRα) is a transcription factor that plays key roles in atheroprotection, since it controls the regulation of HDL genes participating in the reverse cholesterol transport pathway and it inhibits the expression of pro-inflammatory genes in macrophages. The mechanisms that regulate the expression of LXRα in macrophages, hepatocytes and other cell types are still not clear. Thus, in Part II of this thesis we focused on the regulation of the LXRα promoter in hepatic cells by inflammatory or metabolic stimuli. To identify regulatory elements in hLXRa promoter that are involved in these processes, we performed transient transfection assays both in human hepatoblastoma (HepG2) and human embryonic kidney (HEK) cells utilizing a series of luciferase reporter plasmids containing consecutive 5΄ deletions of the hLXRα promoter along with inflammatory stimuli such as Toll Like Receptor 4 (TLR4) which is the natural receptor of LPS or metabolic stimuli such as Hepatocyte Nuclear Factor 4 (HNF-4). We observed that overexpression of TLR4 inhibited hLXRa promoter activity through the activation of Nuclear Factor κappa B (NF-κΒ) in an IKKβ (inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase b)-independent pathway On the contrary we observed that overexpression of HNF4 in HepG2 cells
4
induced hLXRα promoter activity through the -111/-45 region of the promoter, indicating an antagonism between NF-κB and HNF4 in hLXRa promoter activity.
(EN)
