Η σηματοδότηση Νotch είναι ένας εξελικτικά συντηρημένος μηχανισμός που καθορίζει την κυτταρική τύχη κατά την ανάπτυξη πολλών ιστών. Η ενεργοποίηση της σηματοδότησης ξεκινά με την αλληλεπίδραση του διαμεμβρανικού υποδοχέα Νotch με τους προσδέτες Delta και Serrate του γειτονικού κυττάρου, επίσης διαμεμβρανικές πρωτεΐνες. Προηγούμενα πειράματα έχουν δείξει ότι η ουβικουϊτινυλίωση των προσδετών και η επακόλουθη ενδοκυττάρωση τους είναι απαραίτητη για την αποστολή του σήματος Νotch. Όμως, δεν είναι γνωστό με ποιο τρόπο η ενδοκυττάρωση των προσδετών εξυπηρετεί την σηματοδότηση. Στην παρούσα εργασία εξετάσαμε με γενετικές μεθόδους ποιοι πρωτεϊνικοί παράγοντες, γνωστοί για την συμμετοχή τους στα αρχικά στάδια του μηχανισμού ενδοκυττάρωσης, χρειάζονται για την αποστολή σήματος από το Delta. Από τους παράγοντες που εξετάστηκαν, η Αμφιφυσίνη και το Disabled δεν είναι απαραίτητοι για την αποστολή σήματος. Η πρωτεΐνη Eps15 φαίνεται επίσης να μην απαιτείται για την σηματοδότηση, αν και υπάρχει αμφιβολία αν το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο που χρησιμοποιήθηκε είναι πλήρως ανενεργό, ενώ για την κλαθρίνη και την α-Ανταπτίνη δεν μπορέσαμε να φτάσουμε σε κάποιο αποτέλεσμα, καθώς οι μεταλλαγές τους παρουσιάζουν φαινότυπο κυτταρικής θνησιμότητας. Επίσης, η πρωτεόλυση της ενδοκυτταρικής περιοχής του Delta από την Πρεσενιλίνη δεν χρειάζεται για την αποστολή του σήματος και ελέγχεται αν η πρωτεόλυση του εξωκυττάριου τμήματος του Delta από το Kuzbanian θα έχει το ίδιο αποτέλεσμα. Τέλος, δημιουργήσαμε στελέχη μυγών στα οποία το ενδοκυττωτικό μονοπάτι σημαίνεται από μια GFP-ουβικουϊτίνη χιμαιρική πρωτεΐνη, και που στη συνέχεια θα χρησιμοποιηθούν για να παρατηρηθεί η ενδοκυττωτική πορεία που ακολουθεί το Delta μέσα στο κύτταρο.
(EL)
Notch signaling is an evolutionarily conserved mechanism that determines cell fate during development of many tissues. Activation of signaling begins upon interaction of transmembrane Notch receptor with the transmembrane ligands Delta and Serrate of the neighboring cell. Previous experiments have shown that ubiquitination of ligands and their subsequent endocytosis is necessary for Notch signal sending. However, it is not known in what way ligand endocytosis facilitates signalling. In the present work we examined, using genetic approaches, which protein factors, known for their involvement at the initial stages of endocytosis mechanism, are required for signal sending by Delta. Among the tested factors, Amphiphysin and Disabled are not necessary for signal sending. Eps15 protein seems, also, not required for signaling, although there is doubt whether the mutated allele that was used was completely inactive, while for clathin and α-Adaptin we could not get results, as their mutations exhibit a cell lethal phenotype. In addition, proteolytic cleavage of the intacellular part of Delta by Presenilin is not required for signal sending and it is being tested whether proteolytic cleavage of the extacellular part of Delta by Kuzbanian will give the same result. Finally, we constructed fly stocks in which the endocytic pathway is marked by a GFP-ubiquitin fusion protein, and which will be used in the future in order to observe the endocytic route that Delta follows in the cell.
(EN)
