Ο ρόλος της πρωτεΐνης Neuralized τουποντικού ως E3 λίγασης ουβικουιτίνης στη ρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού Notch

RDF 

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share



Semantic enrichment/homogenization by EKT
2006 (EN)
The role of mouse Neuralized protein as an E3 ubiquitin ligase in Notch signaling pathway
Ο ρόλος της πρωτεΐνης Neuralized τουποντικού ως E3 λίγασης ουβικουιτίνης στη ρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού Notch

Κουτέλου Ευαγγελία

Μοσχονάς, Νικόλαος

Το σηματοδικό μονοπάτι Notch (N) αποτελεί έναν από τους πιο σημαντικούς μηχανισμούς διακυτταρικής επικοινωνίας και ρυθμίζει πληθώρα αναπτυξιακών διαδικασιών τόσο σε ασπόνδυλα όσο και σε σπονδυλωτά. Ανωμαλίες στη λειτουργία του σχετίζονται με μεγάλη ποικιλία αναπτυξιακών ελαττωμάτων και παθολογικών καταστάσεων, γεγονός που δείχνει την αναγκαιότητα αυστηρής ρύθμισης της μεταγωγής του σήματος. Πλήθωρα πρωτεϊνών έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί για την ικανότητά τους να ρυθμίζουν σε πολλαπλά επίπεδα τόσο τον υποδοχέα Ν όσο και τους δεσμευτές του, ενώ ένας καθοριστικός μηχανισμός ρύθμισης φαίνεται να είναι η απομάκρυνσή τους από την κυτταροπλασματική μεμβράνη και η αποικοδόμησή τους. Η ρύθμισης της συγκέντρωσης του δεσμευτή και του υποδοχέα που φτάνει στην κυτταροπλασματική μεμβράνη και ενεργοποιεί τη σηματοδότηση, αλλά και η εξασθένηση του σήματος με την απενεργοποίηση αυτών των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών φαίνεται να ρυθμίζεται μέσω της ουβικουιτινιλίωσης και της ενδοκύττωσής τους. Δύο πρωτεΐνες που παίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση των δεσμευτών Delta και Serrate είναι οι Ε3 λιγάσες ουβικουιτίνης Neuralized (Neur) και Mind Bomb(Mibl). Η ανάλυση της λειτουργίας των πρωτεϊνών αυτών τόσο στη δροσόφιλα όσο και στα σπονδυλωτά (Xenopus laevis και Danio rerio), έχει δώσει σημαντικές πληροφορίες για τον καθοριστικό ρόλο της ουβικουιτινιλίωσης στη ρύθμιση της ενδοκύττωσης και αποικοδόμησης των δεσμευτών. Η προσπάθεια κατανόησης αυτών των γεγονότων σε ολοένα μεγαλύτερη λεπτομέρεια αποκαλύπτει την πολυπλοκότητα του μηχανισμού ρύθμισης της σηματοδότησης Ν στο χρόνο και στο χώρο. Παρά το γεγονός ότι η λειτουργία της πρωτεΐνης Mibl του ποντικού φαίνεται να ρυθμίζει τη σηματοδότηση Ν, η συμμετοχή της πρωτεΐνης Neuralized-like (Neurl) σε αντίστοιχες διαδικασίες δεν έχει ακόμη αποσαφηνιστεί. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής αρχικά δείξαμε την δράση του Neurl ως Ε3 λιγάση ουβικουϊτίνης και ότι αυτή εξαρτάται από τη περιοχή RING της πρωτεΐνης. Το Neurl μονο-ουβικουϊτιλιώνει ειδικά το Jagged1 in vitro, ενώ οι υπόλοιποι δεσμευτές του Notch δεν φαίνεται να αποτελούν άμεσα υποστρώματα της πρωτεΐνης. Παράλληλα, δείξαμε την δυνατότητα του Neurl να επάγει την αποικοδόμηση των Jaggedl, 2 και Dili, Dll4 μετά από ταυτόχρονη υπερέκφρασή τους σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών. Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν τις πρώτες σημαντικές πληροφορίες για τη συμμετοχή της πρωτεΐνης Neurl στη ρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού Ν των θηλαστικών. Στη συνέχεια, με ανάλυση φασματοσκοπίας μάζας σε πρωτεϊνικά κλάσματα κυτταρικών σειρών μόνιμης υπερέκφρασης του Neurl, επιβεβαιώσαμε την αλληλεπίδραση του με πρωτεΐνες που προηγουμένως είχαν προσδιοριστεί με το σύστημα δύο υβριδίων του σακχαρομύκητα, ενώ ταυτοποιήσαμε επιπλέον πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις που υποδηλώνουν πιθανή μυριστοϋλίωση της πρωτεΐνης και τη συμμετοχή της σε πολλαπλές κυτταρικές διαδικασίες, όπως ακριβώς είχε προταθεί από το εργαστήριό μας σε προηγούμενες μελέτες. Ακόμη, δείξαμε ότι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις του Neurl συσχετίζονται με τη ενδοκυττάρια τοπογραφία και τη λειτουργία του. Είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον το ότι τα ενδοκυττάρια επίπεδα της πρωτεΐνης φαίνεται να ρυθμίζονται μέσω ουβικουϊτινιλίωσης όπως και ότι η στόχευσή της στην κυτταροπλασματική μεμβράνη, εξαρτάται από τη πιθανή μυριστοϋλίωσης της. Σημειακές μεταλλαγές που εμποδίζουν αυτές τις δύο τροποποιήσεις, φαίνεται να αναστέλλουν την ικανότητα του Neurl να επάγει την αποικοδόμηση των δεσμευτών του Ν υποδηλώνοντας πιθανή συσχέτιση της ρύθμισης της λειτουργίας της πρωτεΐνης με τη θέση της στη μεμβράνη του κυττάρου. Τέλος δείξαμε ότι η συμβολή του Neurl στην αποικοδόμηση των δεσμευτών του Ν δεν φαίνεται να απαιτεί τη μεταξύ τους άμεση αλληλεπίδραση, σε αντίθεση με την αλληλεπίδραση με το Jaggedl που είναι άμεση και απαιτεί την επανάληψη NEUZ2. Αυτό επιβεβαιώνει την πρόβλεψη ότι οι επαναλήψεις NEUZ ευθύνονται για πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις και στην περίπτωση του Neurl, αναγνωρίζουν την πρωτεΐνη-στόχο για ουβικουιτινιλίωση. Από τα παραπάνω αποτελέσματα συμπεραίνεται ότι η πρωτεΐνη Neurl του ποντικού μέσω της δράσης της ως Ε3 λιγάση ουβικουϊτίνης ρυθμίζει άμεσα ή έμμεσα την ουβικουιτινιλίωση των δεσμευτών του Notch συμμετέχοντας έτσι στο σηματοδοτικό μονοπάτι Ν. (EL)
Notch (N) signaling constitutes an evolutionary conserved mechanism that mediates cell-cell interactions in many different cellular contexts in development. Consistent with its profound and widespread roles across a range of tissues, its dysfunction results in a tremendous variety of developmental defects and adult pathologies. A great variety of regulatory proteins have been found to interact with Notch and its ligands and control signaling at multiple levels. More recent advances have highlighted that ubiquitination and endocytosis followed by endosomal sorting of both the receptor and its ligands is an essential mechanism by which Notch-mediated signaling is regulated. Two E3 ubiquitin ligases in drosophila, Neuralized (Neur) and Mind Bomb (Mib1) have been shown to play a crucial role in the regulation of Delta and Serrate protein levels. The functional analysis of these two proteins both in invertebrates and vertebrates has provided the first evidence for the role of ubiquitination in the regulation of endocytosis and degradation of Notch ligands. Intensive work from numerous laboratories has been done in order to clarify the multiple regulatory steps of ubiquitination and endocytosis that are mediated by those two ubiquitin ligases, revealing in parallel the complexity of N signaling fine-tuning in time and space. Mouse homologue of Mib1 protein is known to interact with N ligands and regulate their signaling activity, whereas mouse Neuralized-like (Neurl) protein contribution in N signaling regulation had not been elucidated. In an effort to understand the function of mouse Neurl protein we first investigated its role as an E3 ubiquitn ligase. We showed that Neurl acts as an E3 ubiquitin ligase in vitro and its activity depends on a functional RING domain that resides at the C-terminal of the protein. Neurl specifically mono-ubiquitinates the intracellular domain of Jagged1 in vitro, whereas Dll1, Dll4 and Jag2 do not act as subtrates for Neurldependent ubiquitination. However, Neurl overexpression in cells enhances the degradation of all Notch ligands that contain lysine residues in their intracellular domain. In parallel to our biochemical approach, we used the powerful tool of multidimensional protein identification technology (MudPIT) to identify proteins Neurl interacts with, after analysis of cell lines that stably express Flag-tagged Neurl .We were able to verify the interaction of Neurl with NuMA1, a large nuclear protein required for spindle organization during mitosis that our lab had previously identified as a strong Neurl interactor with the use of yeast-two-hybrid system. We also provided evidence for multiple Neurl post-translational modifications that seem to tightly regulate the protein’s function. More specifically, we showed that Neurl is targeted to the plasma membrane after its putative myristoylation and it gets rapidly degraded possibly via the proteasome. Point mutations that abolish its myristoylation and the functionality of its RING domain severely impair Neurl-dependent degradation of the Notch ligands Dll1, Dll4, Jag1 and Jag2, demonstrating the importance of these modifications in the regulation of Neurl function. Despite the regulatory effects of Neurl on all four N ligands, we were able to identify the direct interaction of Neurl only with Jag1, which is specifically mediated by NEUZ2 repeat. These results suggest that mouse Neurl can either directly or indirectly enhance the ubiquitination and subsequent degradation of N ligands, providing the first evidence for Neurl regulatory role in mammalian Notch pathway. (EN)

text

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

2006-12-19




*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)