Για να κατανοήσουμε το ρόλο που διαδραματίζουν τα χημικά στοιχεία (κυρίως μέταλλα) ή την επίδραση των μεταβολών των συγκεντρώσεων αυτών σε ένα βιολογικό οργανισμό, είναι σημαντικό να μπορούμε να τα προσδιορίζουμε ποσοτικά στο επίπεδο ενός κυττάρου παρά στο επίπεδο ενός ιστού, αποτέλεσμα συνδυασμού διαφορετικών τύπων κυττάρων. Η συμβατική μέθοδος προσδιορισμού μετάλλων σε κυτταρικούς πληθυσμούς μέσω της φασματομετρίας μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICP-MS) περιλαμβάνει τη χώνευση ενός κυτταρικού δείγματος με πυκνά οξέα και προσδιορισμού της μέσης μάζας μετάλλου στον κυτταρικό πληθυσμό. Παρόλα αυτά, η δεδομένη μέση μάζα μετάλλου δεν μας δίνει ολοκληρωμένη εικόνα για την κατανομή του δεδομένου μετάλλου σε ένα κυτταρικό πληθυσμό. Κατά συνέπεια, δεν μπορεί να αποδοθεί μέσω των αναλυτικών αποτελεσμάτων κάποια πιθανή διαφοροποιήση στο μεταλλικό περιεχόμενο των κυττάρων.
Η ανάπτυξη της τεχνικής χαρακτηρισμού νανοσωματιδίων μετάλλου με το ICP-MS (SP ICP-MS) έθεσε τις βάσεις για την εκκίνηση της ανάπτυξης της τεχνικής προσδιορισμού μετάλλων σε μεμονωμένα κύτταρα με το ICP-MS (SC ICP-MS). Η λειτουργία της τεχνικής του SC ICP-MS περιλαμβάνει την εισαγωγή αραιών αιωρημάτων κυττάρων (104 -105 κύτταρα στο mL) συνηθέστερα μέσω πνευματικής εκνέφωσης σε ένα υψηλής θερμοκρασίας πλάσμα Αργού (Ar). Όταν μία σταγόνα που εμπεριέχει ένα κύτταρο εισέλθει στο πλάσμα Ar, τότε θα υποστεί εξάτμιση του διαλύτη, ενώ το κύτταρο θα ατομοποιηθεί στα χημικά στοιχεία που το απαρτίζουν. Τα παραγόμενα άτομα και τα ισότοπά τους θα ιοντιστούν, και τα ιόντα τους θα ανιχνευθούν μετά το πέρασμά-διαχωρισμό τους από τον αναλυτή μαζών.
Ο αριθμός των κυττάρων που εισάγονται στο πλάσμα ανά μονάδα χρόνου, που εξαρτάται από την απόδοση μεταφοράς του συστήματος εισαγωγής και από την αριθμητική πυκνότητα των κυττάρων στο αναλυόμενο αιώρημα, και η γρήγορη καταγραφή (της τάξεως των μs) της έντασης του σήματος είναι στοιχειώδεις πειραματικοί στόχοι που χαρακτηρίζουν την επιτυχή εφαρμογή του SC ICP-MS. Η γρήγορη καταγραφή απαιτείται, καθώς το σήμα από ένα κύτταρο διαρκεί 150-500 μs. Επιπλέον, τα κύτταρα πρέπει να διατηρούνται άθικτα κατά την μεταφορά τους στο ICP.
Στην παρούσα εργασία επιδεικνύεται η ανάπτυξη κι εφαρμογή της μεθόδου SC ICP-MS στη μελέτη της πρόσληψης βαρέων μετάλλων, όπως μόλυβδος (Pb), κάδμιο (Cd) και αρσενικό (As) στη μορφή αρσενικωδών (AsO33-) και αρσενικικών (AsO43-) ανιόντων, από κύτταρα Chlamydomonas reinhardtii επωασμένα σε συγκεντρώσεις των προαναφερθέντων στοιχείων, καθώς και στον προσδιορισμό ενός ενδογενούς για το κύτταρο μέταλλο όπως το ασβέστιο (Ca). Συμπληρωματικά με το συμβατικό σύστημα εισαγωγής στο ICP (Standard Introduction System), συναρμολογείτε ένα υψηλής απόδοσης σύστημα εισαγωγής (HEN Introduction System) με σκοπό την εφαρμογή του στο SC ICP-MS, ενώ τα 11
αποτελέσματα των αναλύσεων SC ICP-MS που εξάγονται με τα δύο συστήματα εισαγωγής συγκρίνονται μεταξύ τους. Ιστογράμματα μάζας μετάλλου ανά κύτταρο δείχνουν ότι η μέση πρόσληψη Cd και As προσδιορίζεται στα 1-3 fg ενώ η μέση πρόσληψη Pb προσδιορίζεται στα 12-17 fg για τις υψηλές συγκεντρώσεις επώασης των κυττάρων στα προαναφερθέντα στοιχεία. Τα αποτελέσματα της επώασης των κυττάρων σε αιθυλένοδιάμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) και ακόλουθης ανάλυσής τους με SC ICP-MS προτείνουν πως το Ca που εντοπίζεται στα κύτταρα βρίσκεται στο κυτταρικό περίβλημα κι επηρεάζεται από τη συγκέντρωση του εξωκυττάριου Ca. Η τεχνική παρουσιάζει αξιοσημείωτη ευαισθησία, προσδιορίζοντας στοιχεία σε επίπεδο ag. Τα αποτελέσματα που εξάγονται με την τεχνική του SC ICP-MS συγκρίνονται με την συμβατική μέθοδο ανάλυσης (Conventional ICP-MS) μέσω υπολογισμού ισοζυγίων μάζας, και η καλή συμφωνία μεταξύ των δύο μεθόδων επιβεβαιώνει την αξιοπιστία του SC ICP-MS.
(EL)
In order to gain a better insight into the metallome of a biological organism and investigate the impact of changes in the concentration levels of elements on biochemical processes taking place in a given biological organism, it is important to quantitate metals in individual cells rather than at the level of a tissue, consisting of different types of cells. The conventional method for quantitating the metal content of a biological sample by using Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS) is by digesting an ensemble of cells and analyzing the resulting digest in order to determine the average metal mass per cell. However, the given average value gives us only half the picture, as the average metal content may not reflect a possible metal content variation.
The development of the method for characterizing metallic nanoparticles through the use of the ICP-MS (SP ICP-MS) set the foundation for the development of a method for determining metals at the single cell level through the use of the ICP-MS (SC ICP-MS). The operation of SC ICP-MS involves the introduction of dilute cell suspensions, that is 104 -105 cells/mL, via pneumatic aspiration into a high-temperature Ar plasma. Upon entering the plasma, each aerosol droplet that contains a cell is evaporated and the remaining single cell is atomized into its constituent elements. The resulting atoms and their isotopes are then ionized, separated by the mass analyzer and detected.
The number of cells entering the plasma per unit of time, depending on the transport efficiency of the introduction system and the cell number density in the suspension, and the fast (μs scale) data acquisition are fundamental goals for the successive application of SC ICP-MS. The fast data acquisition is needed because a cell signal lasts between 150-500 μs. Furthermore, cells should keep their integrity throughout their transport to the plasma. This work demonstrates the development and application of SC ICP-MS to the study of heavy metal, such as lead (Pb), cadmium (Cd) and arsenic (As) in the form of arsenous (AsO33-) and arsenic (AsO43-) anions, uptake by Chlamydomonas reinhardtii cells upon incubation in concentrations of the given metals, as well as to the determination of endogenous metals such as calcium (Ca). A High Efficiency Introduction System (HEN Introduction System) is assembled for the purpose of SC ICP-MS, and the SC ICP-MS results taken with the two Introduction Systems are compared. Histograms depicting the metal amount per cell show that the mean Cd and As uptake is determined at 1-3 fg while the mean Pb uptake is determined at 12-17 fg for cells incubated in the highest metal concentrations. Results emerging from the SC ICP-MS analysis of the cells following their treatment with ethylenediaminotetraacetic acid (EDTA) suggest that Ca is located on the cell wall and is affected by the concentration of the existing dissolved Ca outside the cell. The SC ICP-MS technique demonstrates great sensitivity, as it is in the position to measure ag amounts of metals in single cells. SC ICP-MS is compared with Conventional ICP-MS through mass balance calculations, and the agreement of the two techniques demonstrates the reliability of SC ICP-MS.
(EN)
