Generation of recombinant adenoviruses and transgenic mice bearing mutant apolipoprotein A-I forms for in vivo studies

RDF 

 
Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :
Πανεπιστήμιο Κρήτης
Αποθετήριο :
E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο



Σημασιολογικός εμπλουτισμός/ομογενοποίηση από το EKT
2009 (EL)
Δημιουργία αδενοϊών και διαγονιδιακών ποντικιών που φέρουν μεταλλαγμένες μορφές της απολιποπρωτεϊνης Α-Ι για τη μελέτη των επιπτώσεών τους στο μεταβολισμό της HDL in vivo
Generation of recombinant adenoviruses and transgenic mice bearing mutant apolipoprotein A-I forms for in vivo studies

Τηνιακού, Ιωάννα

Καρδάσης, Δημήτρης

Επιδημιολογικές και κλινικές μελέτες έχουν καταδείξει μια αντιστρόφως ανάλογη συσχέτιση μεταξύ των επίπεδων της HDL χοληστερόλης και του κινδύνου εμφάνισης στεφανιαίας νόσου στον άνθρωπο. Κύριο πρωτεϊνικό συστατικό των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (HDL) αποτελεί η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι, η οποία και κατέχει σημαντικό ρόλο στη βιογένεση, τη δομή, καθώς και τη λειτουργία της HDL. Η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι δρα προστατευτικά ως προς την εμφάνιση καρδιαγγειακών νοσημάτων μέσω των αλληλεπιδράσεων της με άλλες πρωτεΐνες που συμμετέχουν ενεργά στο μεταβολισμό της HDL. Πρόσφατες έρευνες υποστηρίζουν πως η φυσιολογικά αθηροπροστατευτική HDL μπορεί να μετατραπεί σε αθηροματωγόνο ως αποτέλεσμα των οξειδωτικών τροποποιήσεων που υφίσταται η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι από το ένζυμο μυελοπεροξειδάση. Οι τροποποιήσεις αυτές αφορούν σε συγκεκριμένα αμινοξικά κατάλοιπα της πρωτεΐνης μεταξύ των οποίων συγκαταλέγονται τα κατάλοιπα μεθειονίνης και τυροσίνης στις θέσεις 148 και 192, αντίστοιχα. Για τη μελέτη των μηχανισμών δράσης της μυελοπεροξειδάσης που διαταράσσουν τη φυσιολογική λειτουργία της HDL, δημιουργήθηκαν ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί που εκφράζουν τις μεταλλαγμένες μορφές apoΑ-Ι(Met148Ala) και apoΑ-Ι(Tyr192Ala). Για το σκοπό αυτό, αρχικά δημιουργήθηκαν στο γονίδιο της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι με τη μέθοδο του overlapping PCR οι παραπάνω μεταλλάξεις, Met148Ala και Tyr192Ala. Στη συνέχεια, οι apoA-I(Met148Ala) και apoA-I(Tyr192Ala) αλληλουχίες που προέκυψαν, κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλο παλινδρομικό φορέα και οι αντίστοιχοι ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί παράχθηκαν με τη μέθοδο AdEasy. Μελλοντικά, πρόκειται να μελετηθούν οι ιδιότητες αυτών των αδενοϊών τόσο in vitro όσο και in vivo με μεταφορά γονιδίων μέσω αδενοϊών σε επίμυες με έλλειψη apoΑ-Ι (apoΑΙ-/-). Επιπλέον, θα πραγματοποιηθεί ταυτόχρονη μόλυνση επίμυων με αδενοϊούς που εκφράζουν οποιαδήποτε από τα δύο μεταλλάγματα της αποΑ-Ι μαζί με αδενοϊό που εκφράζει τη μυελοπεροξειδάση, με σκοπό να αξιολογηθεί in vivo η επίδραση του ενζύμου αυτού στα επίπεδα των λιπιδίων του πλάσματος, το σχήμα και το μέγεθος της HDL. Το δεύτερο μέρος της παρούσας μελέτης αφορά στη μελέτη της επίδρασης δύο φυσικά απαντώμενων μεταλλάξεων της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι, των apoA-I(Leu141Arg)Pisa και apoA-I(Leu159Arg)Finland στο μεταβολισμό της HDL. Ετεροζυγώτες για οποιαδήποτε από τις δύο παραπάνω μεταλλάξεις παρουσιάζουν πολύ χαμηλά επίπεδα HDL χοληστερόλης στο πλάσμα λόγω της μειωμένης ικανότητας ενεργοποίησης της LCAT. Προηγούμενες μελέτες με πειράματα μεταφοράς γονιδίων μέσω αδενοϊών σε επίμυες με έλλειψη αποΑ-Ι φανερώνουν ότι και οι δύο μεταλλάξεις αδυνατούν να σχηματίσουν είτε δισκοειδή είτε σφαιρικά HDL σωματίδια, και ότι χορήγηση του ενζύμου LCAT μπορεί να διορθώσει τον παθολογικό φαινότυπο της HDL που παρατηρείται. Για την περαιτέρω μελέτη των ιδιοτήτων των συγκεκριμένων δομικών αλλαγών της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι in vivo, δημιούργηθηκαν διαγονιδιακοί επίμυες που φέρουν τις παραπάνω μεταλλάξεις. Για το σκοπό αυτό, η αγρίου τύπου ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη Α-Ι, καθώς και οι apo(Leu141Arg) και apoA-I(Leu159Arg) κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλο φορέα κλωνοποίησης σε κατιούσα θέση σε σχέση με τον TTR1 υποκινητή, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε για την ιστοειδική έκφραση του εκάστοτε διαγονιδίου στο ήπαρ. Στη συνέχεια ακολούθησε απομόνωση των TTR1-apoA-I τμημάτων από τις κατασκευές, τα οποία και χρησιμοποιήθηκαν για την πραγματοποίηση των ενέσεων κατά τη διαδικασία δημιουργίας των διαγονιδιακών ζώων. Η γονοτύπηση των ζώων πραγματοποιήθηκε με τις μεθόδους της PCR και της ανοσοτύπωσης κατά Southern. Μελλοντικά, ένας ιδρυτής από κάθε διαγονιδιακή σειρά πρόκειται να επιλεγεί έτσι ώστε τα πρωτεϊνικά επίπεδα έκφρασης των τριών διαγονιδίων να είναι παρόμοια. Έπειτα τα ζώα αυτά θα διασταυρωθούν με επίμυες με έλλειψη apoΑ-Ι για τη δημιουργία διαγονιδιακών επίμυων που θα εκφράζουν μόνο την αντίστοιχη, είτε αγρίου τύπου είτε μεταλλαγμένη, ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη Α-Ι. Στα ζώα που θα προκύψουν θα θα μελετηθεί η επίδραση της κάθε μετάλλαξης στην ικανότητα αλληλεπίδρασης της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι με άλλους παράγοντες του HDL μονοπατιού, καθώς και στην ομοιόσταση των λιποπρωτεϊνών στο πλάσμα. Η δημιουργία των apoA-I(Leu141Arg)Pisa και apoA-I(Leu159Arg)Finland διαγονιδιακών επίμυων καθιστά δυνατή τη μακροπρόθεσμη και εις βάθος μελέτη του παθολογικού φαινότυπου των συγκεκριμένων μεταλλάξεων. Τέλος, μπορεί να συνεισφέρει σημαντικά στη διαλεύκανση της αιτιολογίας των γενετικής προέλευσης χαμηλών επιπέδων HDL στο πλάσμα, προσφέροντας με αυτόν τον τρόπο νέα προοπτική στη διάγνωση, την πρόγνωση και τη θεραπεία. (EL)
An inverse relationship between the levels of high density lipoprotein (HDL)- cholesterol and the risk of developing cardiovascular disease has been well established. As the major protein component of HDL, apolipoprotein A-I (apoA-I) possesses a critical role in biogenesis, structure and function of this lipoprotein. The atheroprotective properties of apoA-I are mediated through its key-interactions with other factors participating in HDL metabolism. Recent studies have demonstrated that myeloperoxidase (MPO)-dependent oxidation of apoA-I can convert the cardioprotective HDL into dysfunctional forms through targeting of specific methionine and tyrosine residues of apoA-I, such as Met148 and Tyr192. In order to investigate the mechanisms resulting in MPOmediated impediment of normal apoA-I function, the Met148Ala and Tyr192Ala mutations in the apoA-I gene were generated using the overlapping PCR method. The apoA-I(Met148Ala) and apoA-I(Tyr192Ala) sequences were subsequently cloned into the appropriate shuttle vector and the respective recombinant adenoviruses were generated using the AdEasy method. The properties of each of the Ad-GFP-apoA-I mutants will be studied both in vitro and in vivo through adenovirus-mediated gene transfer in apoA-I knockout mice. Finally, co-infection of the mice with adenoviruses expressing either of the two mutants and human MPO will also be performed to assess the in vivo effect of MPO on plasma lipids, size and shape of HDL. The present study also addressed another aspect of the role of apoA-I in HDL biogenesis and function; the effect of two naturally occurring apoA-I mutations, apoA-I(Leu141Arg)Pisa and apoA-I(Leu159Arg)Finland, on HDL metabolism. Heterozygous subjects for either mutation exhibit very low plasma HDL-cholesterol levels attributed to apoA-I’s reduced capacity of LCAT activation. Previous studies in our laboratory using adenovirus-mediated gene transfer in apoA-I deficient mice have demonstrated that both mutations fail to form discoidal or spherical HDL particles and that treatment with LCAT can restore the aberrant HDL phenotype present in these cases. In order to further study the properties of these structural mutations in apoA-I in vivo, transgenic mice carrying these naturally occurring variants of human apoA-I, apoA-I(Leu141Arg)Pisa and apoA-I(Leu159Arg)Finland, were generated. In this context, wild-type hapoA-I, hapoA-I(Leu141Arg) and hapoA-I(Leu159Arg) were subcloned into the pBluescript-TTR1 vector, downstream of the TTR1 promoter which was used to drive the liver-specific expression of the transgenes. Following preparation of the TTR1-apoA-I injection fragments and transgenesis procedures, the founders for each line were identified by genotyping using both PCR and Southern Blot. Next, one founder of each line will be selected according to the expression levels of each transgene in a way that all three founders will exhibit similar protein levels of human apoA-I. The selected founders will be subsequently crossed with apoA-I -/- mice in order to transfer the transgenic lines in an apoA-I deficient background. Finally, these mice will be used for studying the effect of these mutations on the interactions between apoA-I and other factors involved in key-steps of HDL metabolism. Moreover, the contribution of these mutants in the molecular mechanisms affecting HDL biogenesis and lipoprotein homeostasis in the plasma will also be evaluated. Overall, the generation of hapoA-I(Leu141Arg)Pisa and hapoA-I(Leu159Arg)Finland transgenic mice will provide long-term animal models that will facilitate in-depth investigation of their abnormal phenotype and could possibly uncover the etiology of genetically determined low levels of HDL, offering a new perspective in diagnosis, prognosis or even therapy. (EN)

text

Απολιποπρωτεϊνη Α-Ι
HDL
Μυελοπεροξειδάση
Recombinant adenovirus
Lipoproteins
Λιποπρωτεϊνες
Ανασυνδυασμένος αδενοϊος
Διαγονιδιακά ποντίκια
Apolipoprotein A-I
Transgenic mice
Myeloperoxidase

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

2009-12-14




*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.