Ο καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί την τρίτη κατά σειρά αιτία θανάτου
παγκοσμίως που προέρχεται από κακοήθεις νεοπλασίες και αφορά εξίσου άνδρες και
γυναίκες. Η παθογένειά της εξακολουθεί να είναι άγνωστη, ωστόσο έχει δειχθεί ότι
στην ανάπτυξη της νόσου, που είναι μία πολυδιάστατη διαδικασία και ξεκινά από το
σχηματισμό των πολυπόδων έως την εμφάνιση διηθητικού καρκίνου, συμβάλλουν
γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες.
Σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των όγκων έχουν οι σύνθετες
αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων, της εξωκυττάριας θεμέλιας
ουσίας (ECM) και των γειτονικών φυσιολογικών κυττάρων. Η σύσταση της ECM
επηρεάζει σημαντικές λειτουργίες των φυσιολογικών και των καρκινικών κυττάρων,
όπως ο πολλαπλασιασμός, η προσκόλληση, η μετανάστευση και η διαφοροποίηση.
Ένα από τα κύρια συστατικά του εξωκυττάριου χώρου και της κυτταρικής μεμβράνης
είναι οι πρωτεογλυκάνες (PGs), οι οποίες μέσω του πρωτεϊνικού τους κορμού ή
διαμέσου των γλυκοζαμινογλυκανικών (GAGs) τους αλυσίδων, είναι ικανές να
αλληλεπιδρούν με μακρομόρια του εξωκυττάριου χώρου, όπως το κολλαγόνο, οι
αυξητικοί παράγοντες, οι υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων και τα μόρια
προσκόλλησης, συμμετέχοντας με τον τρόπο αυτό στη ρύθμιση των κυτταρικών
λειτουργιών.
Η υπάρχουσα γνώση σχετικά με τα μοριακά χαρακτηριστικά των
καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου και ιδιαίτερα του στρώματός τους, καθώς
και η συσχέτισή τους με την εξέλιξη της νόσου, είναι περιορισμένη. Η μελέτη της
δομής και του ρόλου των GAGs/PGs που παράγονται από τα καρκινικά κύτταρα του
παχέος εντέρου αλλά και από τα κύτταρα του μικροπεριβάλλοντός τους παρουσιάζει
εξαιρετικό ενδιαφέρον καθώς συμμετέχουν στην ανάπτυξη των κακοήθων
νεοπλασιών. Η μελέτη των αλληλεπιδράσεων των καρκινικών κυττάρων και του
εξωκυττάριου χώρου έχει ως σκοπό την αναζήτηση πιο αποτελεσματικών
θεραπευτικών παρεμβάσεων σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου.
Περίληψη
IV
Στα πλαίσια της παρούσας έρευνας μελετήθηκε η σύνθεση και η κατανομή
των GAGs στο υλικό καλλιέργειας και στην κυτταρική μεμβράνη των HT29 και
SW1116 ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών του παχέος εντέρου. Τα
αποτελέσματα έδειξαν ότι αμφότερες οι κυτταρικές σειρές, οι οποίες εκφράζουν τον
οιστρογονικό υποδοχέα ERβ, παράγουν υαλουρονικό οξύ (HA), εξωκυττάριες και
μεμβρανικές γαλακτοζαμινογλυκάνες (GalAGs) καθώς και θειϊκή ηπαράνη (HS). Τα
HT29 κύτταρα συνθέτουν ΗΑ, GalAGs και HS σε σημαντικά μεγαλύτερες ποσότητες
σε σύγκριση με τα SW1116 κύτταρα.
Μελετήθηκε επίσης η επίδραση της γενιστεΐνης (genistein) στη σύνθεση των
παραπάνω εκκρινόμενων και μεμβρανικών GAGs, καθώς και στον πολλαπλασιασμό
των HT29 και SW1116 κυττάρων. Ο μηχανισμός δράσης της γενιστεΐνης επί του
κυτταρικού μεταβολισμού, μέσω της αναστολής της πρωτεΐνης κινάση της τυροσίνης
(PTK) και/ή της αλληλεπιδρασής της με τους οιστρογονικούς υποδοχείς (ERs), είναι
γνωστός. Η δοσοεξαρτώμενη ανασταλτική επίδραση της γενιστεΐνης τόσο στη
σύνθεση των εκκρινόμενων και των μεμβρανικών GAGs/PGs των SW1116
κυττάρων, όσο και στο ρυθμό ανάπτυξής τους, εισηγούνται τη συμμετοχή ενός PTK
μηχανισμού. Από την άλλη μεριά, η σύνθεση των GAGs/PGs από τα HT29 κύτταρα
παρουσία της γενιστεΐνης επηρεάζει τον τύπο και την κατανομή τους, υποδηλώνοντας
την ενεργή συμμετοχή των ERs, γεγονός που ενισχύθηκε και από την αύξηση του
πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετά τη χορήγηση χαμηλών συγκεντρώσεων
γενιστεΐνης.
Έχει δειχθεί ότι ποιοτικές ή ποσοτικές αλλαγές στην παραγωγή των
GAGs/PGs και συνεπώς αλλαγές της σύστασης της ECM μπορεί να επηρεάσουν την
ανάπτυξη ορισμένων καρκινικών όγκων. Επόμενος στόχος ήταν η μελέτη της
επίδρασης των ενδογενών και των εξωγενώς προστιθέμενων GAGs στον
πολλαπλασιασμό των HT29, SW1116 και HCT116 καρκινικών κυττάρων του παχέος
εντέρου του ανθρώπου. Χρησιμοποιήθηκαν εξωγενώς προστιθέμενες αλυσίδες
θειϊκής χονδροϊτίνης (CSΑ), θειϊκής δερματάνης (DS), ηπαρίνης (heparin),
υαλουρονικό οξύ, αναστολέας της σύνθεσης των ενδογενών GAGs/PGs και ειδικές
γλυκοσιδάσες για την απομάκρυνση των μεμβρανικών GAGs. Τα αποτελέσματα
έδειξαν ότι ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου
Περίληψη
V
αυξάνεται από την εξωγενή προσθήκη ηπαρίνης, ενώ δεν επηρεάζεται από την
παραγωγή των ενδογενών GAGs/PGs, γεγονός που σχετίζεται με το μοτίβο της
θείωσής τους.
Πολυάριθμοι μηχανισμοί για τη δράση της ηπαρίνης έχουν προταθεί, όπως η
ρύθμιση ποικίλων αυξητικών παραγόντων και των υποδοχέων τους, η ρύθμιση της
δραστηριότητας των πρωτεϊνικών κινασών που ενεργοποιούνται από μιτογόνα
(MAPKs) καθώς και η διαφοροποίηση της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου.
Συγκεκριμένα, οι HSPGs/ηπαρίνη έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν την ικανότητα
πρόσδεσης του βασικού αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών (FGF-2) στους
υποδοχείς του, FGFR1-4, λειτουργώντας ως συνυποδοχείς. Ο ενεργός ρόλος του
FGF-2 μονοπατιού σηματοδότησης στα αρχικά στάδια της ογκογένεσης του παχέος
εντέρου είναι γνωστός. Επίσης, έχει αναφερθεί ότι οι αλυσίδες HS αυξάνουν τον
πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου μέσω ενός
μηχανισμού που σχετίζεται με την αυξημένη έκφραση των υποδοχέων του
επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF). Σκοπός της παρούσας φάσης της μελέτης
ήταν να εξεταστεί η πιθανή συμμετοχή των FGF-2 και EGF σηματοδοτικών
μονοπατιών στον επαγώμενο από την ηπαρίνη πολλαπλασιασμό των καρκινικών
κυττάρων του παχέος εντέρου. Η χορήγηση στα κύτταρα ειδικού αντισώματος που
εμποδίζει τη δράση του FGF-2, καθώς και η χρήση ειδικού αναστολέα της δράσης
του υποδοχέα του EGF, έδειξε ότι η διεγερτική επίδραση της ηπαρίνης στον
πολλαπλασιασμό των HT29, SW1116 και HCT116 καρκινικών κυττάρων του παχέος
εντέρου δεν πραγματοποιείται μέσω των σηματοδοτικών μονοπατιών των FGF-2 και
EGFR.
Στη συνέχεια, λαμβάνοντας υπόψιν τον ήδη γνωστό ρόλο της σηματοδότησης
των MAPKs στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου,
εξετάσαμε τη συμμετοχή των MAP κινασών στη μιτογονική δράση της ηπαρίνης. Τα
αποτελέσματα έδειξαν ότι η διεγερτική επίδραση της ηπαρίνης στον ρυθμό
ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου σχετίζεται με την
ενεργοποίηση της p38 κινάσης. Η χορήγηση ειδικού αναστολέα της p38 κινάσης
ανέστειλε σημαντικά τον επαγώμενο από την ηπαρίνη πολλαπλασιασμό των HT29,
SW1116 και HCT116 κυττάρων, σε αντίθεση με τους αναστολείς των JNK και
Περίληψη
VI
MEK1/2 κινασών που δεν είχαν καμία επίδραση. Επίσης, η ηπαρίνη μέσω ενός p38-
εξαρτώμενου μηχανισμού τροποποίησε την έκφραση των γονιδίων και των
πρωτεϊνών p21WAF/cip1, p53 και κυκλίνης D1 που σχετίζονται με τον κυτταρικό
κύκλο, ενισχύοντας τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παχέος
εντέρου. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι η ηπαρίνη αυξάνει το ποσοστό των κυττάρων
στη φάση S του κυτταρικού κύκλου και προάγει την εξέλιξή του μέσω ενός p38-
εξαρτώμενου μηχανισμού, ενώ δεν επηρέαζει το ρυθμό της απόπτωσης των
κυττάρων. Η μελέτη αυτή εισάγει έναν καινούριο ρόλο της ηπαρίνης στη ρύθμιση του
πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου μέσω του
σηματοδοτικού μονοπατιού της p38 MAP κινάσης.
(EL)
Colon cancer is one of the leading causes of cancer-associated death among
men and women worldwide. It has been shown that genomic instability, as well as
environmental factors can be correlated to the risk of colon cancer however, the
pathogenesis of the malignancy still remains unknown. Many colorectal cancers are
thought to arise from adenomatous polyps in the colon.
The complex interactions among the cancer cells, their extracellular matrix
(ECM) and the surrounding normal cells are thought to play a pivotal role in tumor
development and progression. The composition of the ECM affects various cellular
functions, such as proliferation, adhesion, migration and differentiation.
Proteoglycans (PGs), major constituents of the ECM, through their core proteins or
via their glycosaminoglycan (GAG) chains are able to interact with collagens, growth
factors, growth factor receptors and adhesion molecules and through these
interactions may participate in the regulation of many cellular events.
The molecular characteristics of colon cancer cells and their stroma, as well as
their association with the development and the progression of the malignancy have
not been adequately studied. The structural analysis and the role of GAGs/PGs that
are produced by colon cancer cells and the surrounding cells may contribute to the
better understanding of these glycocomplexes, which participate in the regulation of
numerous cellular events, as well as in the cell malignant transformation. The
understanding of the interactions among cancer cells and their microenvironment may
contribute to colon cancer treatment.
In this study, the synthesis and the distribution of GAGs among the cell
membrane and the culture medium by two human colon cancer cells, HT29 and
SW1116 were examined. The results demonstrated that both estrogen receptorpositive
(ER+) cancer cell lines produced hyaluronan (HA), both extracellular and
membrane-associated galactosaminoglycans (GalAGs) and heparan sulfate (HS), with
the HT29 cells producing all GAG fractions at significantly higher rates.
Abstract
VIII
The effects of genistein on the synthesis of these secreted or cell-associated
macromolecules, as well as on the growth of HT29 and SW1116 cell lines were also
studied. It is well known that the soy isoflavone genistein can affect cell metabolism
by specifically inhibiting protein tyrosine kinase (PTK) and/or interacting with the
estrogen receptors (ERs). The observed dose-dependent inhibitory effect of genistein
on the synthesis of both secreted and cell-associated GAG/PG by the SW1116 cells,
as well as on their growth, was suggestive of a PTK mechanism. On the other hand,
the synthesis of GAGs/PGs by HT29 cells in the presence of genistein was dependent
on their type and localization which implies the active participation of the ERs, which
was further supported by the observed growth stimulation at low concentrations of
genistein.
Quantitative and qualitative changes in GAGs/PGs production, and
consequently in the ECM composition, have been suggested to have a role in the
development of some types of cancer. Therefore, the effects of endogenous and
exogenously added GAGs on the proliferation of HT29, SW1116 and HCT116 human
colon cancer cell lines were examined. For this purpose exogenously added GAGs
(chondroitin sulfate-CS, dermatan sulfate-DS, hyaluronan-HA and heparin), an
inhibitor of endogenous GAG sulfation and specific glycosidases to cleave cellassociated
glycosaminoglycans were utilized. The obtained results showed that colon
cancer cell growth was exclusively stimulated by exogenously added heparin and
insensitive to endogenous GAGs/PGs production, in a sulfation pattern-related
manner. Numerous mechanisms of heparins’ action have been postulated including
the regulation of growth factors / growth factor receptors, mitogen activated protein
kinases (MAPKs) activities or the modulation of cell cycle progression. Specifically,
HSPGs/heparin have been demonstrated to increase the affinity of FGF-2 to its
respective, FGFR1-4, receptors. The active role of FGF-pathways has been suggested
in the early stages of colorectal tumorigenesis. Moreover, it has been shown that HS
chains stimulate the proliferation of colon cancer cells via a mechanism involving
increased expression of tyrosine kinase receptors of EGF. Aim of this study was to
examine the possible involvement of the FGF-2 and EGF signaling on the heparininduced
effect on HT29, SW1116 and HCT116 colon cancer cell lines. Treatment of
Abstract
IX
the tested cell lines with the FGF-2 neutralizing antibody or an EGFR tyrosine kinase
inhibitor showed that the stimulatory effect of heparin on the cells’ growth was not
FGF-2 or EGFR dependent.
In view of the fact that MAPKs signaling involvement on colon cancer cell
growth is well established, three major MAPK pathways, JNK, ERK1/2 and p38,
were examined for their participation on the mitogenic effect of heparin. The results
showed that heparin-induced stimulation of colon cancer cell growth was correlated to
increased phosphorylation of p38 MAP kinase. Treatment with a highly specific p38
kinase inhibitor significantly inhibited colon cancer cell heparin-induced growth,
while administration of JNK or MEK1/2 kinase inhibitors had no significant effect.
Furthermore, heparin through a p38-dependent mechanism modulated the expression
of p21WAF1/cip1, p53 and cyclin D1 cell cycle regulators in a manner supportive of
colon cancer cell proliferation. Heparin treatment also promoted cell cycle
progression in cells with increased S-phase entry via a p38-dependent mechanism. On
the other hand, treatment with heparin did not appear to affect HT29, SW1116 and
HCT116 cell apoptosis rates. This study introduces a new role of heparin in the
regulation of colon cancer cell proliferation through p38 MAP kinase signaling.
(EN)
