Δημιουργία φυτών Nicotiana benthamiana με πλήρη καταστολή των DCL γονιδίων με την χρήση του συστήματος CRISPR/Cas9

 
This item is provided by the institution :
University of Crete
Repository :
E-Locus Institutional Repository
see the original item page
in the repository's web site and access all digital files if the item*
share




2017 (EN)
Production of DCL knock-out Nicotiana benthamiana plants using CRISPR/Cas9 system
Δημιουργία φυτών Nicotiana benthamiana με πλήρη καταστολή των DCL γονιδίων με την χρήση του συστήματος CRISPR/Cas9

Μήττα, Ελένη Σ.

Τσαγρή, Ευθυμία
Καλαντίδης, Κρίτων
Βόντας, Ιωάννης

Η RNA σίγηση (RNA silencing ή RNA interference, RNAi) περιγράφει την εμπλοκή μορίων RNA σε μηχανισμούς γονιδιακής ρύθμισης που οδηγούν στη παρεμπόδιση της έκφρασης ή της μετάφρασης των γονιδίων-στόχων. Κύριο χαρακτηριστικό όλων αυτών των μοριακών μονοπατιών είναι η παραγωγή μικρών μορίων RNAs (miRNAs και siRNAs), μεγέθους 20-24 νουκλεοτιδίων, από τις Dicer-like (DCL) πρωτεΐνες. Στη Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) έχουν βρεθεί τέσσερις DCL πρωτεΐνες, κάθε μια από τις οποίες παράγει μικρά μόρια RNAs συγκεκριμένου μεγέθους που έχουν συγκεκριμένη λειτουργία. Το ενδιαφέρον για την μελέτη της λειτουργίας αυτών των πρωτεϊνών, σε συνδυασμό με την ανάπτυξη της τεχνικής CRISPR/Cas9 ως εργαλείο για την πλήρη καταστολή γονιδίων, μας ώθησαν στην χρήση της τεχνικής CRISPR/Cas9 με σκοπό την πλήρη καταστολή των DCL γονιδίων. Ένα λειτουργικό σύστημα CRISPR/Cas9, αποτελείται από ένα μόριο RNA (sgRNA), ομόλογο με την προς στόχευση αλληλουχία DNA και από μια ενδονουκλεάση Cas9, η οποία οδηγείται από το sgRNA στην αλληλουχία στόχο, δημιουργώντας δίκλωνα ρήγματα στο συγκεκριμένο σημείο του γονιδιώματος. Έτσι αποκτήθηκε πλασμίδιο που περιέχει το γονίδιο της Cas9 και σχεδιάστηκαν νέα πλασμίδια που φέρουν μια αλληλουχία υπεύθυνη για την έκφραση sgRNA που στοχεύουν τα προς καταστολή γονίδια (DCL2, DCL3 ή DCL4) σε συγκεκριμένες περιοχές. Τα πλασμίδια αυτά αρχικά χρησιμοποιήθηκαν για την παροδική έκφραση του συστήματος (έλεγχος λειτουργικότητας του συστήματος CRISPR/Cas9, με παροδική έκφραση των επιμέρους στοιχειών του) και στη συνέχεια, για τη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών που υπερεκφράζουν τα sgRNA ή την Cas9. Μετά από την διασταύρωση των παραπάνω φυτικών σειρών και την απόκτηση φυτών που εκφράζουν την Cas9 και κάποιο sgRNA που στοχεύει ένα από τα προς μελέτη γονίδια ακολούθησε η ανίχνευση και ταυτοποίηση των προκληθέντων μεταλλάξεων στα φυτά C1 και C2 γενιάς. Από τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης φαίνεται ότι επιτεύχθηκε η απόκτηση φυτών με γενετικές τροποποιήσεις στα γονίδια των DCL2 και DCL3, ενώ η ανάλυση για το DCL4 γονίδιο δεν ολοκληρώθηκε. Η εργασία θα ολοκληρωθεί με την πραγματοποίηση δοκιμών λειτουργικότητας των πρωτεϊνών για να εξακριβωθεί με ακρίβεια η καταστολή τους. Όλα τα φυτά πλήρους καταστολής των DCL πρωτεϊνών θα πρέπει μελλοντικά να συγκριθούν με φυτά που παρουσιάζουν μερική καταστολή για τις πρωτεΐνες αυτές μέσω RNAi (DCLi φυτικές σειρές). Έτσι, μελετήθηκε στις DCLi φυτικές σειρές (και σε φυτά που προκύπτουν από την διασταύρωση τους), η παραγωγή μικρών RNA κατά την παροδική έκφραση ενός μεταγράφου GFP με δομή φουρκέτας (hairpin), καθώς επίσης, μελετήθηκε και η διαφορά μολυσματικότητας δυο RNA ιών (CMVGR21 και TRV-GFP). Αυτά τα πειράματα θα λειτουργήσουν ως πρότυπο σύγκρισης για τα φυτά με πλήρη καταστολή των DCL πρωτεϊνών που βρίσκονται σε διαδικασία δημιουργίας. Συνοψίζοντας, σε αυτή την εργασία, περιγράφουμε τη μέθοδο για την απόκτηση φυτών με στοχευμένη μετάλλαξη σε επιθυμητά γονίδια. Αυτά τα φυτά θα είναι ένα εξαιρετικό εργαλείο για την μελέτη διαφόρων βιολογικών λειτουργιών, όπως ο ρόλος των DCL πρωτεϊνών σε περιπτώσεις ιικών μολύνσεων ή υπερέκφρασης πρωτεϊνών. (EL)
RNA silencing (or RNA interference) is a RNA depended gene regulatory mechanism that inhibits via different pathways the transcription or the translation of a gene and thus reduces protein production. Small RNA molecules (siRNA and miRNA) which are produced by Dicer-like (DCL) enzymes, play a leading role in these processes. In Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) four DCL proteins have been detected, each producing small RNAs with specific size and function. The interest in studying these proteins, alongside with the establishment of CRISPPR/Cas9 system as a gene editing tool, prompted us on producing plants with complete loss of function (knock-out) for the DCL proteins. A CRISPR/Cas9 system needs a Cas9 nuclease that is guided to the target sequence by small guide RNA (sgRNA) that provides targeting specificity. Then Cas9 causes a double strand break within the DNA target. We used this system and we have produced plasmids that contain a sgRNA sequence targeting DCL2, DCL3 or DCL4 genes. These plasmids, combined with a Cas9 plasmid were used for transient expression of all the necessary compounds in order to confirm functionality of CRISPR/Cas9 in-vivo. In addition, these plasmids were used for plant transformation producing plants that stably overexpress one of the designed sgRNA or Cas9 and they were crossed to each other. Next step was the detection and identification of induced mutations in F1 and F2 generation. In this work, we provide evidences that the generated plants contain mutations in DCL2 and DCL3 genes. Furthermore, plants which carry mutations for DCL4 genes were also generated, and screened but further analysis is required. All the DCL knock-out plants that will be produced throughout this project should be compared with plants showing partial suppression of such proteins (DCLi plant lines). Therefore, in this study we also show the production of small RNA in the transient expression of a transcript with hairpin structure and the infectivity difference of two viruses (CMVGR21 and TRV-GFP ) on DCLi plant lines (and in plants resulting from their crosses). These experiments will serve as the standard of comparison to plants with complete suppression of DCL proteins being formed. Together, in this work, we describe the CRISPR targeted genome mutagenesis method for obtaining plants with mutations on the desired genes. These plants will be an excellent tool for studying a variety of biological functions like DCL tasks, like their role in viral infections and in silencing of transgenes. (EN)

text
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

RNA σίγηση
RNA silencing

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Greek

2017-03-17


Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης



*Institutions are responsible for keeping their URLs functional (digital file, item page in repository site)