Το 1% του ανθρώπινου γονιδιώματος κωδικοποιεί πρωτείνες οι οποίες είτε ρυθμίζουν είτε ρυθμίζονται μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με μέλη της οικογένειας των μικρών GTPασών Rho. Μέσω μιας σειράς πολύπλοκων βιοχημικών δικτύων, οι Rho πρωτείνες αποτελούν υψηλά συντηρημένους μοριακούς διακόπτες που ελέγχουν πολλές από τις θεμελιώδεις διαδικασίες της βιολογίας του κυττάρου όπως αυτών της μεταγραφικής ρύθμισης, του πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης και της αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού κατά την μετανάστευση των κυττάρων.
Παράλληλα με τη ρύθμιση της μετατροπής των μορίων αυτών στην ενεργή GTP μορφή, σημαντικό ρόλο για την όλη συμμετοχή τους στις αποκρίσεις των κυττάρων παίζει και η μεταγραφική τους ρύθμιση, η οποία καθορίζει και τα επίπεδα έκφρασής τους στο κύτταρο. Η RhoB είναι το μόνο μέλος της υποοικογένειας των RhoA-related πρωτεινών το οποίο υφίσταται μεταγραφική ρύθμιση η οποία φαίνεται να είναι κεφαλαιώδους σημασίας για τη λειτουργία της λόγω του μικρού χρόνου ζωής της μέσα στα κύτταρα. Πράγματι, μια σειρά από πρόσφατες γονιδιωματικές αναλύσεις της δράσης του TGF-β σε διάφορες κυτταρικές διεργασίες όπως η απόπτωση ή η επιθηλιακο-μεσεγχυματική μετατροπή (ΕΜΤ) κατέστησαν το γονίδιο της RhoB ως έναν από τους κύριους μεταγραφικούς στόχους του σηματοδοτικού μονοπατιού του TGF-β.
Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή είχε ως σκοπό αρχικά τον έλεγχο της μεταγραφικής ενεργοποίησης του γονιδίου της μικρής GTPάσης RhoB από τον TGF-β και στη συνέχεια τη διεξοδική μελέτη του ή των σηματοδοτικών μονοπατιών τα οποία εμπλέκονται άμεσα ή έμμεσα στην ενεργοποίηση αυτή. Επίσης, μελετήθηκε η μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου της RhoB από άλλους μεταγραφικούς παράγοντες όπως ο Sp1 και μέλη της οικογένειας της ογκοκατασταλτικής πρωτείνης p53.
Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας όσον αφορά τη μεταγραφική ρύθμιση από τον TGFβ συνοψίζονται ως εξής :
α) Ο TGFβ προκαλεί μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της RhoB σε διάφορους τύπους κυττάρων όπως τα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα HaCaT, τα κύτταρα ηπατώματος HepG2 και οι ινοβλάστες ποντικού Swiss-3T3. β) Στην ενεργοποίηση της μεταγραφής της RhoB από τον TGFβ εμπλέκεται τόσο το μονοπάτι των ΜΑΡΚ κινασών και συγκεκριμένα των κινασών ERK1 και 2, όσο
και αυτό των Smad πρωτεινών. Τα δύο μονοπάτια αυτά όμως φαίνεται να έχουν διακριτούς και ανεξάρτητους ρόλους. Συγκεκριμένα, η δράση του μονοπατιού των ΜΑΡΚ κινασών είναι πιο άμεση δηλ. παρατηρείται μεταξύ των 3 πρώτων ωρών επίδρασης με TGFβ και ενδεχομένως να είναι υπεύθυνη για την έναρξη της μεταγραφικής ρύθμισης. Αντίθετα, η δράση του μονοπατιού των Smad πρωτεινών εντοπίζεται μετά από μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα επίδρασης με TGFβ και πιθανόν να είναι υπεύθυνη για τη μακρόχρονη διατήρηση της ενεργοποίησης της μεταγραφής της RhoB και κατ’επέκταση του φαινοτύπου της αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού της ακτίνης από τον TGFβ. γ) Η επίδραση με TGFβ για 24 ώρες προκαλεί ουσιαστική αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης σε κύτταρα HaCaT στα οποία είναι εμφανής η αλλαγή στη μορφολογία και η δημιουργία οργανωμένου δικτύου ινιδίων ακτίνης. Η παρουσία του αναστολέα της ΜΕΚ κινάσης όχι μόνο δεν φαίνεται να ελαττώνει το φαινόμενο της αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού από τον TGFβ αλλά μοιάζει να το εντείνει ακόμη περισσότερο. Το αποτέλεσμα αυτό ενδεχομένως σχετίζεται με μια μικρή μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της RhoA από τον αναστολέα της ΜΕΚ κινάσης. δ) Η υπερέκφραση της συστασιακά ενεργής μορφής του υποδοχέα τύπου Ι του ΤGFβ μέσω ανασυνδυασμένων αδενοϊών προκαλεί αύξηση στη μεταγραφή του γονιδίου αλλά και στα επίπεδα έκφρασης της πρωτείνης RhoB σε κύτταρα HepG2. ε) H λειτουργική ανάλυση του υποκινητή του γονιδίου της RhoB του ανθρώπου έδειξε ότι η περιοχή -78/+19 φαίνεται να είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση από το σηματοδοτικό μονοπάτι των Smad πρωτεινών. στ) Η υπερέκφραση μιας συστασιακά ενεργής μορφής της ογκοπρωτεινης Ras ενεργοποιεί τον υποκινητή της RhoB σε αρκετά σημαντικό βαθμό. Η ενεργοποίηση αυτή όμως εμφανίζεται μειωμένη στις μεταλλαγμένες μορφές του υποκινητή της RhoB -227 /+86 και -78 /+86. ζ) Δεν παρατηρήθηκε συνεργατική δράση των μονοπατιών των ΜΑΡΚ κινασών και των Smad πρωτεινών στη ρύθμιση του υποκινητή της RhoB.
Στο δεύτερο μέρος της μεταπτυχιακής διατριβής, διερευνήθηκε η μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου της RhoB από τον παράγοντα Sp1. Όπως βρέθηκε από τις πειραματικές αναλύσεις, ο παράγοντας Sp1 φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής της RhoB καθώς η μιθραμυκίνη, ένα φάρμακο το οποίο παρεμποδίζει τη πρόσδεση του σε περιοχές πλούσεις σε GC, προκαλεί σημαντική μείωση στα βασικά επίπεδα έκφρασης της RhoB. Η υπερέκφραση του Sp1 προκαλεί ισχυρή ενεργοποίηση του υποκινητή της RhoB
ο οποίος φαίνεται να διαθέτει 3 θέσεις πρόσδεσης του στα σημεία -660, -123 και -104.
Στο τρίτο και τελευταίο μέρος της παρούσας ερευνητικής εργασίας, μελετήθηκε η δράση των μελών της οικογένειας της p53 στη ρύθμιση του υποκινητή του γονιδίου της RhoB. Βρέθηκε ότι το μόνο μέλος της οικογένειας το οποίο φαίνεται να ρυθμίζει τη μεταγραφή της RhoB και μάλιστα να προκαλεί σημαντική ενεργοποίηση στον υποκινητή της είναι η p73. Η παρατήρηση αυτή ενισχύει την άποψη ότι μέλη της οικογένειας της p53 έχουν επικαλυπτόμενους αλλά και διακριτούς ρόλους. Η ελάχιστη περιοχή του υποκινητή της RhoB η οποία είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση από την p73 είναι η -78/+86 . Διαπιστώθηκε η ύπαρξη συνεργατικής δράσης μεταξύ της p73 και του παράγοντα Sp1 στην ενεργοποίηση του υποκινητή της RhoB.
Η μελέτη της ρύθμισης της RhoB τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε πρωτεινικό επίπεδο πρόκειται να δώσει σημαντικά στοιχεία για τον τρόπο λειτουργίας της και να οδηγήσει σε βαθύτερη κατανόηση των ιδιαίτερων λειτουργικών χαρακτηριστικών της. Η μελέτη της συνεργατικής δράσης (cross talk) της ταχείας αλλά και μακροχρόνιας (γενωμικής) ενεργοποίησης της RhoB από τον TGFβ κατά την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης σε συνδυασμό με την γνωστή αντικαρκινική της δράση μπορεί να οδηγήσει στη δημιουργία νέων εργαλείων για την θεραπεία νοσημάτων όπως ο καρκίνος.
(EL)
One percent of the human genome encodes for proteins that regulate or are regulated by members of the Rho-GTPases family. Rho proteins are characterized as molecular switches that control many of the fundamental processes of cell biology like transcriptional regulation, cell growth, apoptosis and cytoskeleton reorganization during cell migration.
Whereas the classical Rho GTPases are regulated by GDP/GTP cycling, in some cases transcriptional regulation, which determines the expression levels of the proteins in the cell, plays also a crucial role in their function. RhoB is the only member of the RhoA-related subfamily that is transcriptionally regulated and this regulation seems to be of high importance for its function due to the short half-life of this protein in the cell. In a series of DNA microarray studies of TGFβ-induced cell processes like epithelial-mesenchymal transition (EMT) and apoptosis led to the discovery of RhoB as one of the most critical transcriptional targets of TGFβ pathway.
In the present study, we investigated the molecular mechanisms that control RhoB gene expression at the transcriptional level. In the first part, we sought to determine whether RhoB is transcriptionally activated by TGFβ and which TGFβ-induced pathways are responsible for this upregulation. In the second and third part, we studied the transcriptional regulation of RhoB by other transcription factors such as Sp1 and members of p53 family of tumor suppressor proteins.
The results of our study concerning the role of TGFβ in RhoB activation are concluded below:
a) TGFβ activates transcriptionally the RhoB gene in different cells types such as human keratinocytes (HaCaT), hepatoma cells (HepG2) and mouse fibroblasts (Swiss3T3) b) in this upregulation are involved both the MAP kinase pathway, specifically kinases ERK1/ERK2, and the Smad pathway but the two pathways seem to have independent roles. The pathway of MAP kinases acts during the first 3 hours of TGFβ treatment and probably it is responsible for the early eventsin RhoB transcriptional regulation. On the contrary, the Smad pathway acts at later timepoints and presumably it is responsible for the retention of transcriptional activation of the RhoB gene and by this way retention of the phenotype of actin cytoskeleton reorganization caused by TGFβ c) TGFβ treatment for 24hours results in obvious reorganization of actin cytoskeleton
(stress fibers) in HaCaT cells. The use of MEK inhibitor U0126 induced this reorganization presumably due to the small transcriptional upregulation of the RhoA gene caused by the MEK inhibitor. d) Overexpression of a constitutively active TGFβ receptor type I by the use of recombinant adenoviruses resulted in the upregulation of RhoB at the transcriptional and protein level in HepG2 cells e) A functional characterizaton of RhoB promoter showed that the region between nucleotides -78 and +19 is necessary and sufficient for transactivation of RhoB promoter by the Smad proteins. f) Overexpression of a constitutively active oncoprotein Ras (Ras ca) transactivates the RhoB promoter (-726 +86). This specific activation is reduced in mutants -227/+86 and -78/+86 of RhoB promoter. g) We didn’t observe synergistic interactions between the pathways of MAP kinases and Smad proteins in the regulation of the RhoB promoter.
In the second part of our study, we investigated the role of Sp1 in the transcriptional activation of RhoB gene. Our experimental data showed that Mithramycin, a drug that inhibit the binding of Sp1 to GC-rich motives in the promoters of genes, has a negative effect on the basal levels of transcription of RhoB gene. Overexression of Sp1 induces the activity of RhoB promoter. The RhoB promoter consists of three Sp1 binding sites (-660, -123 and -104).
In the third part of this study, we investigated the importance of p53 family in the transactivation of the RhoB promoter. We showed that among the members of this family, only p73 regulates the transcription of RhoB gene by activating its promoter. This observation supports previous observations showing that p53 family members have overlapping but distinct roles on target genes. The minimum region that is responsible for transactivation by p73 is -78 /+86. Finally, we observed synergistic interactions between p73 and Sp1 in transactivation of RhoB promoter.
The study of RhoB regulation at the transcriptional and protein level will provide important information regarding its function and may lead to a deeper understanding of its special functional characteristics. Studying the role of RhoB in actin cytoskeleton reorganization caused by TGFβ in addition to its known anticancer action, may lead to the discovery of novel tools for the treatment of diseases such as cancer.
(EN)
