Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η φασματοσκοπική μελέτη των κυτοχρωμάτων b και c1 της κυτοχρωμικής αναγωγάσης από τον οργανισμό Thermus thermophilus. Η κυτοχρωμική αναγωγάση αποτελεί το τρίτο κατά σειρά σύμπλοκo της αναπνευστικής αλυσίδας. Αποτελείται από έντεκα υπομονάδες στην περίπτωση του μιτοχονδριακού συμπλόκου και μονάχα από τρεις σε εκείνη του βακτηριακού. Αυτές οι τρεις υπομονάδες είναι και εκείνες που περικλείουν τα καταλυτικά κέντρα της πρωτεΐνης. Πρόκειται για τα κυτοχρώματα b, c1 και μία πρωτεΐνη σιδήρου-θείου, γνωστή και ως πρωτεΐνη Riskie. Τα ενεργά κέντρα των κυτοχρωμάτων b και c1, που μελετώνται στην παρούσα εργασία είναι αίμες τύπου b και c αντίστοιχα. Συγκεκριμένα, στο κυτόχρωμα b εντοπίζονται οι αίμες b566 και b562, χαμηλού και υψηλού spin αντίστοιχα, ενώ στο κυτόχρωμα c1, η αίμη c1. Σε αυτή την εργασία μελετώνται, με χρήση FTIR φασματοσκοπίας, τα σύμπλοκα των ανηγμένων κυτοχρωμάτων b και c1 με το μονοξείδιο του άνθρακα και το ιόν του κυανίου. Συγκεκριμένα, ο σίδηρος της αίμης b562 δεσμεύει CO δημιουργώντας τόσο μονοκαρβονυλικά όσο και δικαρβονυλικά σύμπλοκα. Αντίθετα, στην περίπτωση του κυτοχρώματος c1, δεν παρατηρήθηκε δέσμευση CO. Ειδικότερα, βρέθηκε ότι το μονοκαρβονυλικό σύμπλοκο b562CO παρουσιάζει τρεις διαφορετικές διαμορφώσεις, οι σχετικές εντάσεις των οποίων μεταβάλλονται με την αλλαγή του pH. Επιπλέον, είναι δυνατή η φωτοδιάσπασή του, αποκαλύπτοντας χρήσιμες πληροφορίες για τη δομή της πρωτεΐνης. Η ύπαρξη του δικαρβονυλικού συμπλόκου που αναφέρεται για πρώτη φορά, είναι ιδιαίτερης σημασίας, εγείροντας σημαντικά ερωτήματα σχετικά με την αντικατάσταση του αμινοξέος που αποτελεί το φυσικό αξονικό υποκαταστάτη του σιδήρου. Κατ'αναλογία, μελετήθηκε και η δέσμευση του ιόντος του κυανίου στα οξειδωμένα κυτοχρώματα b και c1. Σε αντίθεση με την περίπτωση του μονοξειδίου του άνθρακα, το κυτόχρωμα c1 δημιουργεί σύμπλοκα με CN-. Τα σύμπλοκα αυτά, που βρίσκονται σε απόλυτη συμφωνία με ήδη δημοσιευμένες μελέτες σε πρωτεΐνες που εμφανίζουν ανάλογες προσθετικές ομάδες, δεν παρουσιάζουν ευαισθησία στην αλλαγή του pH ή σε εναλλαγή διαλύτη Η2Ο/D2O. Ωστόσο, σε υψηλό pH, δημιουργείται ένα νέο σύμπλοκο που για πρώτη φορά αποδόθηκε στην πρωτονιωμένη κατάσταση του κυτοχρώματος c1-CN-.
(EL)
The aim of the present study is the spectroscopic investigation of cytochromes b and c1 from Thermus thermophilus cytochrome reductase. Cytochrome reductase is an essential component in cellular respiration. As opposed to eleven subunits in the mitochondrial reductase, the bacterial counterpart consists of only three subunits: cytochrome c1 containing a c-type heme, cytochrome b with two b-type hemes, a high potential (b562) and a low potential one (b566) and the Riskie iron-sulfur protein holding the Riskie center. In this work, we have investigated the complexes of reduced cytochromes b and c1 with carbon monoxide and cyanides anion, by FTIR spectroscopy. The iron of heme b562 binds CO forming both monocarbonyl as well as biscarbonyl complexes. However, this is not the case for cytochrome c1. Particularly, the monocarbonyl b562CO complex presents three discrete conformations with relative intensities varying with pH changes. Furthermore, this specie can be photodissociated by a diode laser beam, providing useful information for the protein backbone. Additionally, the detection of the biscarbonyl complex, reported for the first time, yields important implications regarding the ligand binding to hemes. The binding of CN- to the oxidized cytochromes is also investigated. As opposed to the case of CO, cytochrome c1 can form cyanide complexes. Such species are fully consistent with previously reported cyanide complexes with other ferric heme-proteins. They are found to be independent in pH changes and Η2Ο/D2O exchange. Though, in high pH value, a new complex is formed and for the first time, it is assigned to the protonated cytochrome c1 CN-.
(EN)
