Τα miRNA είναι μικρά ρυθμιστικά RNA μόρια που προσδένονται σε μερικώς συμπληρωματικές αλληλουχίες του 3΄UTR των mRNA και παρεμποδίζουν την μετάφρασή τους. Κάθε miRNA στοχεύει ένα μεγάλο αριθμό μεταγράφων ασκώντας με αυτόν τον τρόπο πλειοτροπικό έλεγχο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Σήμερα η εύρεση και η περεταίρω πειραματική απόδειξη των miRNA:mRNA αλληλεπιδράσεων συγκεντρώνει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον. Πρόσφατες εργασίες εμπλέκουν βασικούς παράγοντες της βιογένεσης των miRNA στη ρύθμιση της διαίρεσης και την διατήρηση της ταυτότητας των αρχέγονων γαμετικών κυττάρων στην Drosophila melanogaster.
Στην παρούσα εργασία αρχικά παρουσιάζεται η in-vivo πειραματική απόδειξη της αρνητικής μετα-μεταγραφικής ρύθμισης που επιβάλλει το miR-13 στο γονίδιο CG10222 μέσω του 3΄UTR του, στην Drosophila. Για τον σκοπό αυτό παρήχθησαν και αναλύθηκαν διαγονιδιακές σειρές «αισθητήρες» στις οποίες το γονίδιο ανταποκριτής EGFP συνδέθηκε με το αγρίου τύπου CG10222-3΄UTR ή με κατάλληλα τροποποιημένες παραλλαγές του. Η έκφραση της EGFP σε προνύμφες τρίτου σταδίου παρέμεινε χαμηλή παρουσία του αγρίου τύπου CG10222-3΄UTR, ενώ αντίθετα ανήλθε σε φυσιολογικά επίπεδα όταν το σημείο πρόσδεσης για το miR-13 είχε αλλοιωθεί. Αντίστοιχα, η παραγωγή κλώνων κυττάρων όπου απουσίαζαν τα miRNA συντέλεσε στην άνοδο των επιπέδων έκφρασης του αισθητήρα. Επιπροσθέτως παρατηρήθηκε ότι η μετα-μεταγραφική αρνητική ρύθμιση που επέβαλε το miR-13 στο CG10222 υπερίσχυε του ρυθμού μεταγραφής από τον ενδογενή υποκινητή. Παράλληλα με τα παραπάνω, μελετήθηκε το φαινόμενο της αυθόρμητης σίγησης των διαγονιδίων ως παραπροϊόν του γενετικού μετασχηματισμού της Drosophila.
Με οδηγό την απόκριση της χίμαιρας EGFP/CG10222-3΄UTR απέναντι στο miR-13 οι σειρές αισθητήρες αποτέλεσαν ένα βασικό εργαλείο για τη μελέτη του προτύπου ενεργότητας των miRNA στην αρσενική γαμετική σειρά. Η ανάλυση της έκφρασης της EGFP σε όρχεις από προνύμφες τρίτου σταδίου και ενήλικα άτομα αποκάλυψε υψηλή miR-13 ενεργότητα στα πρώιμα προ-μειωτικά γαμετικά κύτταρα. Κατά την ωρίμανση των σπερματοκυττάρων, πριν την είσοδό τους στην μείωση, η ενεργότητα του miR-13 σταδιακά αναιρέθηκε. Το ίδιο πρότυπο ενεργότητας καταγράφηκε κατά την ανάλυση σειρών αισθητήρων και για άλλα miRNA προτείνοντας την γενίκευση των παρατηρήσεων για όλα συνολικά τα γαμετικά εκφραζόμενα miRNA.
Η ανίχνευση του προτύπου έκφρασης ενός miRNA από την υποοικογένεια miR-2/miR-13 έδειξε ότι παράγονταν και σε ωριμότερους πληθυσμούς προ-μειωτικών σπερματοκυττάρων όπου δεν ήταν πλέον ενεργό. Βάση αυτής της παρατήρησης δημιουργήθηκαν ενδείξεις για την ύπαρξη ενός ενεργού μηχανισμού αναχαίτισης της δράσης των miRNA κατά την περίοδο ωρίμανσης των σπερματοκυττάρων. Η miRNA-ελεγχόμενη σίγηση του ανταποκριτή έγινε καθολική όταν οι σειρές αισθητήρες συνδυάστηκαν γενετικά με τα μεταλλάγματα των spermatocyte arrest, sa και off-schedule, ofs. Αντίθετα το πρότυπο σίγησης δεν αλλοιώθηκε στα μεταλλάγματα των always early και boule, τα οποία φυσιολογικά δραστηριοποιούνται στον ίδιο κυτταρικό πληθυσμό. Η συσχέτιση των ευρημάτων της παρούσας εργασίας οδηγεί σε ένα μοντέλο κατά το οποίο τα miRNA εκφράζονται και δρουν στα πρώιμα γαμετικά κύτταρα της αρσενικής σειράς. Κατά την πρόοδο της σπερματογένεσης, στο στάδιο των ωριμαζόντων σπερματοκυττάρων, τα γονίδια sa και ofs ακυρώνουν την δράση των miRNA μέχρι που τα miRNA παύουν να παράγονται.
(EL)
miRNAs are small regulatory RNA molecules that bind to partially complementary sequences at the 3΄UTR of mRNAs and impair their translation. Each miRNA is able to target multiple transcripts exerting in this way a pleiotropic effect on the regulation of gene expression. Nowadays, the identification and further experimental justification of miRNA:mRNA interactions attract intense scientific interest. It has recently been reported that key-factors of miRNA biogenesis are involved in the control of germ stem cell division and maintenance in Drosophila melanogaster.
Initially, this study provides in-vivo experimental evidence for the negative post-transcriptional regulation of gene CG10222 in Drosophila by miR-13 through the 3΄UTR sequence. “Sensor” transgenic lines were therefore produced and analyzed, where the reporter gene EGFP was fused to the wild type or appropriately mutated versions of CG10222-3΄UTR. EGFP expression in third instar larvae remained low in the presence of the wild type CG10222-3΄UTR, while it was restored to normal levels when the binding site for miR-13 was mutated. Correspondingly, miRNA-free cell clones exhibited high sensor expression levels. It was also observed that the post-transcriptional negative regulation imposed by miR-13 on CG10222 prevailed over the endogenous transcriptional rate. In parallel, transgene spontaneous silencing, as a by-product of the genetic transformation of Drosophila, was also studied.
Based on the response of EGFP/CG10222-3΄UTR towards miR-13, sensor lines became a valuable tool in investigating the miRNA activity pattern in the male germ line. Through the analysis of EGFP expression in testes taken from third instar larvae and adult individuals, it was observed that miR-13 was highly active only in the early pre-meiotic sperm progenitor cells. As spermatogenesis reached the spermatocyte growth stage, miR-13 activity gradually disappeared. The same activity pattern was revealed after analyzing sensor lines for other miRNA implying that all germ line expressed miRNA exhibit this general activity profile.
The detection of the expression pattern for one member of the miR-2/miR-13 subfamily revealed that it was further produced in late pro-meiotic spermatocyte populations, where it was no longer active. This observation suggested the presence of an active mechanism that intercepted miRNA activity during the spermatocyte growth period. When the sensor lines were tested under spermatocyte arrest (sa) and off-schedule (ofs) mutant backgrounds, the reporter exhibited silencing in all cell types. On the contrary, the silencing pattern was not affected in always early and boule mutants, although these genes are activated during the same spermatogenesis stage. The combined findings of this study lead to a model where miRNAs are expressed and act in the early sperm progenitor cells. As germ line differentiation proceeds through the spermatocyte growth period, sa and ofs genes gradually block miRNA activity until the point where miRNA expression ceases.
(EN)
