In vitro μελέτη της δράσης αυξητικών παραγόντων και κινάσης της τυροσίνης στην οργάνωση του εξωκυττάριου δικτύου κυτταρικών σειρών οστεοσαρκώματος

 
Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :
Πανεπιστήμιο Κρήτης
Αποθετήριο :
E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο




2008 (EL)
In vitro μελέτη της δράσης αυξητικών παραγόντων και κινάσης της τυροσίνης στην οργάνωση του εξωκυττάριου δικτύου κυτταρικών σειρών οστεοσαρκώματος

Nikitovic-Τζανακάκη, Dragana

Κρασαγάκης, Κωνσταντίνος
Κουμαντάκης, Ευγένιος
Τσατσάκης, Αριστείδης
Καραμάνος, Νίκος
Ζαφειρόπουλος, Αλέξανδρος
Κατώνης, Παύλος
Κραμποβίτης, Ηλίας

Tο οστεοσάρκωμα είναι ο πιο κοινός όγκος των οστών στα παιδιά και τους εφήβους. Το κύριο χαρακτηριστικό του οστεοσαρκώματος είναι ο κακοήθης μετασχηματισμός των οστεοβλαστικών κυττάρων και η συσσώρευση άφθονης, ημιτελώς ασβεστοποιημένης, εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ECM). Το άφθονο περιεχόμενο της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας αλλάζει το μικροπεριβάλλον των οστών και έχει επιπτώσεις στην κανονική λειτουργία των οστεοβλαστικών κυττάρων και στη διαφοροποίηση των κακοήθων κυττάρων. Oι πρωτεογλυκάνες (PGs) είναι μια απο τις κύριες τάξεις μακρομορίων της κυτταρικής μεμβράνης και του εξωκυττάριου χώρου. Περιέχουν ένα πρωτεϊνικό κορμό με τον οποίο εíναι συνδεδεμένες ομοιοπολικά μια ή περισσότερες θειωμένες αλυσíδες γλυκοζαμινογλυκανών (GAGs). Οι αλυσίδες των GAGs είναι γραμμικά πολυμερή αποτελούμενα από επαναλαμβανόμενες δισακχαριδικές μονάδες που περιέχουν μια εξωζαμίνη και ένα ουρονικό οξύ ή γαλακτόζη στην περίπτωση της θειϊκής κερατάνης. Oι ιδιαίτερες φυσικοχημικές ιδιότητες των PGs τις καθιστούν ρυθμιστές της οργάνωσης του εξωκυττάριου χώρου, ενώ συμμετέχουν στη ρύθμιση πληθώρας κυτταρικών γεγονότων, όπως η κυτταρική προσκόλληση, η μετακίνηση, η διαφοροποίηση και ο πολλαπλασιασμός τους. Η ρυθμιστική δράση των PGs πραγματοποιείται μέσω των αλληλεπιδράσεων τους με δραστικά μακρομόρια του εξωκυττάριου χώρου καθώς και με αυξητικούς παράγοντες, είτε μέσω των γλυκανικών αλυσίδων τους είτε μέσω του πρωτεϊνικού τους κορμού. Oι πρωτεογλυκάνες είναι σημαντικά συστατικά των μή κολλαγονοδών μακρομορίων του οστού. Συντίθενται και εκκρίνονται από τους οστεοβλάστες, και συμμετέχουν στον έλεγχο της ασβεστοποίησης των οστών. Επιπλέον, υπάρχουν ενδείξεις ότι οι PGs της κυτταρικής μεμβράνης (κυρίως η θειϊκή ηπαράνη) όπως και οι εκκρινόμενες PGs συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση κύτταρο με κύτταρο και κύτταρο με εξωκυττάρια θεμέλια ουσία και μπορούν να παίζουν σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό και την διατήρηση του οστίτη ιστού. Τα φυσικοχημικά στοιχεία και οι μοριακές αλλαγές της εξωκυττάριας ουσίας του οστεοσαρκώματος, όπως και οι συσχετίσεις αυτών των αλλαγών με την διαφοροποίηση και την πρόγνωση του οστεοσαρκώματος δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς. Ο ρόλος των πρωτεογλυκανών στους μηχανισμούς ανάπτυξης του οστεοσαρκώματος θεωρείται σημαντικός. Η λεπτομερής δομική ανάλυση των υδατανθρακικών αλυσίδων των PGs θα φωτίσει τη βιοχημεία των γλυκοσυζευγμάτων που έχει εξαιρετικό ενδιαφέρον γιατί οι γλυκάνες συμμετέχουν στη ρύθμιση πληθώρας κυτταρικών γεγονότων, καθώς και στην κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων. Ο στόχος της μελέτης αυτής ήταν να συμβάλλει στην κατανόηση του ρόλου συγκεκριμένων PGs/ GAGs στη παθοφυσιολογία του οστεοσαρκώματος, ενός εκ των σημαντικότερων καρκίνων των οστών του ανθρώπου. Χρησιμοποιήσαμε τις MG-63 και Saos 2 κυτταρικές σειρές ανθρώπινου οστεοσαρκώματος, υψηλού και χαμηλού μεταστατικού δυναμικού αντίστοιχα. Αυτές οι κυτταρικές σειρές διαφέρουν μεταξύ τους στο βαθμό διαφοροποίησης, η μια είναι μέτρια και η άλλη καλά διαφοροποιημένη. Σε κυτταρικές καλλιέργειες αυτών των σειρών, μελετήσαμε τη σύνθεση και τη κατανομή των GAGs τόσο στο υλικό καλλιέργειας όσο και την κυτταρική μεμβράνη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αμφότερες οι κυτταρικές σειρές συνθέτουν εξωκυττάριο υαλουρονικό οξύ (HA) καθώς και εκκρινόμενες και κυτταρικά προσκολλημένες γαλακτοζαμινογλυκάνες (GalAGs) και θειϊκή ηπαράνη (HS). Αν και αμφότερες οι κυτταρικές σειρές συνθέτουν αξιοσημείωτες ποσότητες PGs, τα Saos 2 κύτταρα παράγουν HA, GalAGs και HS σε σημαντικά χαμηλότερες ποσότητες από αυτές των MG-63 κυττάρων. Μελετήσαμε επίσης τη δράση της γενιστεϊνης στη σύνθεση αυτών των μορίων. Ο μηχανισμός δράσης της γενιστεϊνης, μέσω της ειδικής αναστολής της πρωτεϊνης της κινάσης της τυροσίνης (PTK), στο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων είναι γνωστός. Η ανασταλτική επίδραση της γενιστεϊνης στη σύνθεση των εξωκυττάρια εκκρινόμενων και των κυτταρικά προσκολλημένων GAGs/PGs στα Saos 2 κύτταρα βρέθηκε να είναι δοσοεξαρτώμενη, και πιο πιθανόν μέσω ενός PTK μηχανισμού. Η σύνθεση των GAGs/PGs από τα MG-63 κύτταρα με την παρουσία της γενιστεϊνης εξαρτάται από το τύπο και την κατανομή, υποδηλώνοντας ένα πιο σύνθετο μηχανισμό που ρυθμίζει την σύνθεση των PGs. Έχει βρεθεί ότι οι GFs όπως, ο αυξητικός παράγοντας του μετασχηματισμού (TGF-β), ο βασικός αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών (bFGF) και ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (PDGF) βοηθούν την ανάπτυξη του οστεοσαρκώματος. Έτσι, θελήσαμε να εξετάσουμε την δράση του TGF-β2, του bFGF και του PDGF-BB στη σύνθεση και κατανομή των GAGs/PGs στις δύο κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η δράση των αυξητικών παραγόντων διαφέρει μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών και ότι η ρύθμιση στη σύνθεση των GAGs εξαρτάται από τον τύπο και την κατανομή τους. Τροποποιήσεις της δομικής σύστασης των συστατικών των GAGs/PGs της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας μπορεί να έχει σημαντικές συνέπειες στο πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή / και τη διαφοροποίηση τους. Σε οστεοβλάστες ανθρώπου, καθώς και στις MG-63 και Saos 2 κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος, χορηγήσαμε στη συνέχεια τους κυριώτερους τύπους αλυσίδων GAGs π.χ τη θειϊκή χονδροϊτίνη (CSA), θειϊκή δερματάνη (DS) και ηπαρίνη (Hep) και μελετήσαμε την επίδρασή τους στην ανάπτυξη αυτών των κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι οι GAGs της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας είναι μακρομόρια που επηρεάζουν τη κυτταρική ανάπτυξη των κακοήθων και των φυσιολογικών κυττάρων οστεοβλαστικής αρχής με μια δοσοεξαρτώμενη συμπεριφορά. Αυτή η επίδραση σχετίζεται στενά με τη λεπτομερή χημική δομή των GAGs, όπως για π.χ. είναι η παρουσία L-ιδουρονικού οξέος και ο βαθμός της θείωσής τους. Η βερσικάνη (versican), μια μεγάλου μεγέθους πρωτεογλυκάνη θειϊκής χονδροϊτίνης και το συνδεδεμένο σε αυτή HA είναι συστατικά της ECM που παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην συμπεριφορά των μετασχηματισμένων κυττάρων. Η έκφραση συγκεκριμένων ισομορφών της βερσικάνης έχει ενοχοποιηθεί για την μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων. Επίσης η διακοπή της σύνθεσης HA μέσω της αναστολής της έκφρασης της συνθάσης 2 (HAS2) στα κύτταρα οστεοσαρκώματος καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό, την κινητικότητα και την διηθητική ικανότητά τους. Επιπρόσθετα, λαμβάνοντας υπ’ όψην ότι ο TGF-β2, ο bFGF και ο PDGF-BB είναι σημαντικοί ρυθμιστές της έκφρασης των μακρομορίων της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, μελετήσαμε την επίδραση αυτών των αυξητικών παραγόντων στην έκφραση των διαφόρων ισομορφών της βερσικάνης, στην σύνθεση της συνθάσης του ΗΑ από τα MG-63 κύτταρα του οστεοσαρκώματος αλλά και από φυσιολογικούς ανθρώπινους οστεοβλάστες του περιοδοντικού συνδέσμου (hPDL). Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι ο TGF-β2 προκαλεί την έκφραση της βερσικάνης και του HA από τα κύτταρα του ανθρώπινου οστεοσαρκώματος ενώ ο PDGF-BB είχε την κύρια επίδραση του στην έκφραση της HAS2 ισομορφής και της βιοσύνθεσης του HA από τους οστεοβλάστες. Συμπερασματικά, ο TGF-β2 μπορεί να έχει ρόλο στη μεταστατική δυνατότητα των κυττάρων του ανθρώπινου οστεοσαρκώματος. Οι μικρές πλούσιες σε λευκίνη πρωτεογλυκάνες (SLRP) όπως είναι η διγλυκάνη (biglycan), η διακοσμιτίνη (decorin), η φιμπρομοδουλίνη (fibromodulin), η λουμικάνη (lumican) και η οστεοαδχερίνη (osteoadherin) είναι οι πιο άφθονες πρωτεογλυκάνες του οστεοειδούς. Το χαρακτηριστικό σε σχήμα πετάλου αλόγου του πρωτεϊνικού τους κορμού, τους επιτρέπει να αλληλεπιδρούν με άλλα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας (κυρίως με ίνες κολλαγόνου), αλλά και με την ανόργανη φάση στη διάρκεια της ασβεστοποίησης. Η έκφραση της λουμικάνης δεν ήταν γνωστή στο ανθρώπινο οστεοσάρκωμα μέχρι την ανάδειξη της από την παρούσα μελέτη. Εξετάσαμε την έκφραση της λουμικάνης στα MG-63 και στα Saos 2 κύτταρα ανθρώπινου οστεοσαρκώματος. Αυτές οι κυτταρικές σειρές ανθρώπινου οστεοσαρκώματος εκφράζουν και εκκρίνουν την λουμικάνη μερικώς γλυκοζυλιωμένη με τις αλυσίδες θειϊκής κερατάνης (KS). Είναι ενδιαφέρον, ότι τα μη μεταστατικά καλώς διαφοροποιημένα Saos 2 κύτταρα παρήγαγαν λουμικάνη επτά φορές περισσότερη συγκρινόμενη με εκείνη που παρήγαγαν τα υψηλής μεταστατικής ικανότητας κύτταρα της MG-63 σειράς. Η χρησιμοποίηση ειδικού siRNA για το γονίδιο της λουμικάνης κατέστειλε τα επίπεδα του mRNA και στις δύο κυτταρικές σειρές. Η ανάπτυξη των Saos 2 κυττάρων ανεστάλη, ενώ η μετανάστευση και η χημειοτακτική απάντηση στην ινονεκτίνη αυξήθηκε από την λουμικάνη. Η έκφραση της λουμικάνης είχε αρνητική συσχέτιση με το βασικό επίπεδο της Smad 2 ενεργοποίησης. Από την άλλη μεριά, αυτές οι κυτταρικές λειτουργίες στα υψηλής επιθετικότητας MG-63 κύτταρα, δεν ήταν ευαίσθητες στην καταστολή των ενδογενών χαμηλών επιπέδων λουμικάνης που παράγουν αυτά τα κύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν ότι η έκφραση της λουμικάνης μπορεί να σχετίζεται θετικά με την διαφοροποίηση των κυττάρων του οστεοσαρκώματος και αρνητικά με την εξέλιξή τους. Η διακοσμιτίνη είναι μια καλά μελετημένη μικρή πλούσια σε λευκίνη πρωτεογλυκάνη για την οποία βρέθηκε ότι έχει ανασταλτική δράση στο πολλαπλασιασμό διαφόρων κυτταρικών σειρών. Έχει αναφερθεί ότι η διακοσμιτίνη επιδρά μέσα από το μονοπάτι του EGFR προκαλώντας απόπτωση / αναστολή ανάπτυξης. Ο σκοπός της παρούσας φάσης της μελέτης μας ήταν να εξετασθεί η ρύθμιση της σύνθεσης της διακοσμιτίνης μετά από χορήγηση του TGF-β2, του PDGF-BB και του bFGF στις MG-63 και Saos 2 κυτταρικές σειρές ανθρώπινου οστεοσαρκώματος όπως και στα κύτταρα ανθρώπινων φυσιολογικών οστεοβλαστών. Επίσης μελετήθηκε η επίδραση της διακοσμιτίνης στην ανάπτυξη των κυττάρων του οστεοσαρκώματος. Βρέθηκε ότι τα MG-63 κύτταρα εκφράζουν την διακοσμιτίνη ενώ τα Saos 2 και τα φυσιολογικά κύτταρα των οστεοβλαστών δεν την εκφράζουν. Η έκφραση της διακοσμιτίνης αυξήθηκε μετά από τη χορήγηση όλων των αυξητικών παραγόντων, ενώ τα Saos 2 και τα φυσιολογικά κύτταρα των οστεοβλαστών δεν διεγέρθηκαν από κανένα από τους αυξητικούς παράγοντες οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για να συνθέσουν την διακοσμιτίνη. Η χορήγηση της διακοσμιτίνης είχε ανασταλτική επίδραση στη ανάπτυξη των Saos 2 κυττάρων, ενώ τα MG-63 κύτταρα δεν επηρεάστηκαν. Η καταστολή της σύνθεσης της διακοσμιτίνης στα MG-63 κύτταρα δεν είχε επίδραση στο πολλαπλασιασμό τους. Αντίθετα, η διακοσμιτίνη φάνηκε να έχει ευεργετική επίδραση στα κύτταρα του οστεοσαρκώματος αφ’ενός διότι ήταν απαραίτητη για την μετανάστευση των MG-63 κύτταρων και αφ’ετέρου διότι εμπόδισε την επαγώμενη από το TGF-β2 κυτταροστατική λειτουργία. Η ανάλυση αυτών των δραστηριοτήτων της διακοσμιτίνης στα MG-63 κύτταρα έδειξε ότι δεν επάγει την έκφραση της p21WAF-1, ούτε προκαλεί παρατεταμένη αναίρεση και αδρανοποίηση του EGFR. Αντίθετα, ο EGFR φάνηκε να υπερεκφράζεται και να παραμένει δια μακρόν φωσφορυλιωμένος. Επιπρόσθετα, φάνηκε ότι για τα αυξημένα επίπεδα του EGFR δεν χρειάζεται ενεργοποιημένη σηματοδότηση του EGFR, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να επιτευχθεί σταθεροποίηση των υποδοχέων αυτών μέσω των αλληλεπιδράσεων της εξωκυττάριας διακοσμιτίνης και του EGFR. Σαν συμπέρασμα συνάγεται ότι τα MG-63 κύτταρα είναι ανθεκτικά στην αναστολή της ανάπτυξης που προκαλείται από την διακοσμιτίνη. Το Ν-ακετυλνιουραμινικό οξύ (Neu5Ac) και το Ν-γλυκολυλνιουραμινικό οξύ (Neu5Gc) είναι τα επικρατούντα σιαλικά οξέα (Sia) στα θηλαστικά που συνήθως βρίσκονται στα μη αναγώμενα άκρα των ολιγοζαχαριδικών αλυσίδων στις γλυκοπρωτεϊνες και τα γλυκολιπίδια. Προσδιορίστηκε ότι τα MG-63 κύτταρα παράγουν πάνω από 5 φορές περισσότερο ολικό σιαλικό οξύ συγκρινόμενο με τα Saos-2 κύτταρα. Το Neu5Ac υπολογίστηκε στο περίπου 60% των ολικών σιαλικών οξέων που εκκρίθηκαν από τα MG-63 κύτταρα, ενώ το Neu5Gc ήταν το κύριο σιαλικό οξύ στην κυτταρική μεμβράνη των MG-63 κυττάρων. Τα Saos-2 κύτταρα εκκρίνουν αξιόλογες ποσότητες του Neu5Ac στο υπερκείμενο. Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι τα κύτταρα του ανθρώπινου οστεοσαρκώματος εκφράζουν αμφότερους τους τύπους γλυκοζυζευγμάτων που περιέχουν σιαλικά οξέα, οι δε διαφορές στις ποσότητες του καθενός από τους δύο κύριους τύπους σιαλικών οξέων καθώς και η κατανομή τους μπορεί να σχετίζεται με τις διαφορές τους στην μορφολογία και την μεταστατική τους ικανότητα . (EL)
Osteosarcoma is the most common bone tumor associated with childhood and adolescence. The main characteristics of the osteosarcoma are the malignant transformation of the osteoblasts and the excessive accumulation of the partially mineralized extracellular matrix (ECM). The abundant content of the ECM modulates the microenvironment of the bone tissue and affects the normal function of the osteoblasts as well as the differentiation of the malignant cells. Proteoglycans (PGs) are one of the major classes of macromolecules located both at the cell membrane and the ECM. They consist of a protein core to which one or more sulfated glycosaminoglycan (GAG) chains are covalently bound. GAG chains are linear polymers composed of repeating dissacharide units consisting of a hexosamine and an uronic acid. The specific physicochemical characteristics with which PGs are endowed enable them to affect the organization of the ECM, as well as to participate in the regulation of several cellular events, including cell proliferation, adhesion and migration. These roles of PGs are perpetrated through specific interactions with target macromolecules or growth factors and these interactions may involve both their GAG chains and/or protein cores. PGs are major non-collagen component of the bone ECM. They are synthesized and secreted by osteoblasts and participate in the regulation of bone calcification. Furthermore, it has been suggested that cell membrane (mainly heparan sulfate containing) as well as secreted PGs participate in cell-cell and cell-ECM interactions and play important roles in the in the formation and the renewal of the bone tissue. Both the physicochemical characteristics and the alternations in the composition of the osteosarcoma ECM as well as the association of these changes with its differentiation and prognosis have not been adequately studied. The role of PGs in the mechanisms of osteosarcoma development is suggested to be important. The fine structural analysis of the proteoglycans’ GAG chains may contribute to the better understanding of these glycocomplexes, which participate in the regulation of numerous cellular events as well as in the cell malignant transformation. Therefore, the aim of this study was to contribute to the understanding of the role specific PGs / GAGs have in the pathology of the osteosarcoma, which is one of the most important human primary bone tumors. MG-63 and Saos 2 human osteosarcoma cell lines, endowed with high and low metastatic capability, and differing in their differentiation level, being medium and well differentiated, respectively were utilized. The synthesis and the distribution of GAGs among the cell membrane and the culture medium by these cell lines were studied. The obtained results showed that both cell lines synthesized extracellular hyaluronan (HA) and both extracellular and cell-associated galactosaminoglycans (GalAGs) and heparin sulfate (HS). Even though both cell lines synthesized considerable amounts of PGs, the Saos 2 cells produced HA, GalAGs and HS at considerably lower rates than the MG-63 cells. The role of genistein on the synthesis of these macromolecules has also been studied. Genistein is a well known specific inhibitor of the protein tyrosine kinase (PTK) and affects the proliferation of both cancer and normal cells. The inhibitory effect of genistein on the synthesis of both extracellularly secreted and cell-associated GAGs / PGs in Saos 2 cells was found to be dose-dependent and mediated most probably through a PTK mechanism. The synthesis of GAGs / PGs by the MG-63 cells in the presence of genistein was dependent on their type and localization suggesting that a more complex mechanism regulates their PG synthesis. It has been shown that growth factors such as the transforming growth factor (TGF-β2), basic fibroblast growth factor (bFGF) and the platelet derived growth factor support the growth of osteosarcoma. Therefore, we examined the actions of TGF-β2, bFGF and PDGF-BB on the synthesis and the distribution of the GAGs / PG between the two cell lines. The obtained results showed that the action of the growth factors differs between the two cell lines and that the regulation of the GAG synthesis depends on their type and location. Alternations in the structural composition of the GAG/PG component may have important consequences on the cell proliferation and / or differentiation. Human osteoblasts and the two osteosarcoma cell lines, able to produce galactosaminoglycan (GalAGs) and heparan sulfate (HS)-containing proteoglycans, were treated with their main GAG chain types (i.e. chondtroitin sulfate (CS), dermatan sulfate (DS) and heparin) and the their effects on cell growth were examined. The obtained results showed that exogenous GAGs affect the growth of both normal and cancer cell in a dose-dependent fashion. This effect is closely related the fine chemical structure of GAGs, i.e. the presence of the L-iduronic acid and the degree of sulfation. Versican, large sized chondroitin sulfate PG and its binding partner hyaluronan (HA) are extracellular matrix components that play an essential role in transformed cell behavior. Expression of certain versican isoforms has been implicated in migration and proliferation of cancer cells. Likewise the disruption of HA synthesis by inhibiting hyaluronan synthase-2 (HAS2) expression in osteosarcoma cells inhibits cell proliferation, migration and invasiveness. Considering that growth factors, such as TGF-β2, bFGF and PDGF-BB, are important regulators for the expression of the ECM molecules, in this study we examined the effect of these growth factors on the expression of the various versican isoforms, HA synthases as well as HA synthesis by MG-63 osteosarcoma cells and normal human osteoblastic periodontal ligament cells (hPDL). Our results show that TGF-β2 was the major stimulator of HAS2 isoform expression as well as HA synthesis in osteosarcoma cells, while PDGF-BB exerted dominant influence on HAS2 isoform expression and hyaluronan biosynthesis by osteoblasts. These results indicate that TGF-β2 may account for the metastatic potential of these cells. The small, leucine rich proteoglycans such as biglycan, decorin, fibromodulin, lumican and osteoadherin are the most abundant proteoglycans of the osteoid. The characteristic horse-shoe shape of their protein core enables them to interact with the other ECM components (mainly with collagen fibers) as well as with the inorganic phase during bone mineralization. The expression of lumican by osteosarcoma cells has not previously been reported. We examined the expression of lumican by MG-63 and Saos 2 cell osteosarcoma cells. The two human osteosarcoma cell lines were found to express and to secrete lumican which was partly substituted with keratan sulfate chains glycosaminoglycans. Importantly, the non-metastatic, well differentiated Saos 2 cells produced lumican at rates that were up to seven-fold higher tan the highly metastatic MG-63 cells. The utilization of short interfering RNA specific for the lumican gene resulted in efficient down-regulation of its mRNA levels in both cell lines. The gowth of Saos 2 cells was inhibited by lumican, whereas their migration and chemotactic response to fibronectin were found to be promoted. Lumican expression was negatively correlated with the basal level of Smad activation in these cells, suggesting that lumican may affect the bioavailability of Smad 2 activators. By contrast, these cellular functions of highly aggressive MG-63 cells were demonstrated not to be sensitive to a decrease in their low endogenous lumican levels. These results suggest that lumican expression may be positively correlated with the differentiation and negatively to the progression of the osteosarcoma. Decorin is a well studied SLRP, reported to have inhibitory action on the growth of numerous cell lines. It has been shown that decorin by acting through the EFGR pathway causes apoptosis/ cell growth inhibition. The aim of the present phase of our study was to examine the regulation of decorin synthesis by the MG-63 and Saos 2 cell line as well as by human osteoblasts, after treatment with TGF-β2, PDGF-BB and bFGF. Likewise, the effect of decorin on these cells’ growth was examined. We show that the MG-63 cells in contrast to the Saos 2 cells and the normal osteoblasts express decorin. Furthermore, the expression of decorin by the MG-63 cells was stimulated by all utilized growth factors while none of the treatments induced decorin expression in Saos 2 cell and the normal osteoblasts. Treatment with exogenous decorin inhibited Saos 2 cell growth while neither exogenous decorin nor downregulation of the endogenous decorin synthesis did affect MG-63 cell growth. On the contrary, treatment with decorin seemed to be beneficial to osteosarcoma cells, since it was necessary for MG-63 cell migration and acted as a mediator, counteracting the TGF-β2-induced cytostatic function. In contrast to the established model decorin in MG-63 ce3lls did not induce p21 expression nor cause protracted retraction and inactivation of the EGFR. Conversely, EFGR appeared to be overexpressed and continuously phosphorylated. These results provide new data on pathways that cancer cell might emply to overcome the established decorin-induced growth suppression. N-acetylneuraminic acid and N-glycolylneuraminic acid are the dominant sialic acids in mammals usually found in the non-reducing terminal of oligosaccharide side chains in glycoproteins or glycolipid form. Their expression and distribution pattern has been correlated both with the malignant phenotype and tumor grade of human cancers. Our aim was to examine the synthesis and distribution of sialic acid containing glycoconjugates in human osteosarcoma cell lines and particularly whether the type and content of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylneuraminic acid may be correlated to osteosarcoma metastatic potential. It was determined that the MG-63 and Saos 2 cell lines differ both in the content and distribution of the two sialic acid types. MG-63 cells produce up to 5-fold more total sialic acid as compared to the Saos 2 cells. Neu5Gc is the predominant sialic acid present on the MG-63 cells membrane and represents 40 % of the determined sialic acid by these cells. Saos 2 cell fraction was found to be poor in sialic acid content as only traces of Neu5Ac were detected. However these cells secrete considerable amounts of Neu5Ac to culture media. In conclusion both the total sialic acid and specifically the Neu5Gc content may be correlated to osteosarcoma metastatic potential. (EN)

Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
text

Proteoglycans
Osteosarcoma
Πρωτεογλυκάνες

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

Ελληνική γλώσσα

2008-07-30


Σχολή/Τμήμα--Ιατρική Σχολή--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές



*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.