Εισαγωγή: Τα Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα (MDS) είναι κλονικά νοσήματα των αρχέγονων αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων τα οποία χαρακτηρίζονται από δυσλειτουργική αιμοποίηση στον μυελό των οστών και αυξημένο ρίσκο εξέλιξης της νόσου σε λευχαιμία. Όμως, η παθογένεια των MDS δεν περιορίζεται μόνο στα αρχέγονα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα, το παθολογικό μικροπεριββάλον του Μυελού των οστών (BM) έχει δειχθεί ότι συμβάλει στην ανεπάρκεια του μυελού στους ασθενείς με MDS μέσω αναποτελεσματικής υποστήριξης της αιμοποίησης. Τα μεσεγχυματικα βλαστικά κύτταρα αποτελουν βασικά συστατικά της συστασης της αιμοποιητικής φωλιάς. Εχει δειχθεί οτι τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα τα οποία προέρχονται από ασθενείς με MDS έχουν εγγενή λειτουργικά ελαττώματα και συνεπώς αδυνατούν να διατηρήσουν την φυσιολογική αιματοποίηση. Η αζακυτιδίνη (AZA) είναι ένας υπομεθυλιωτικός παράγοντας ο οποίος αναστελλει την τρανσφεραση μεθυλίου και χρησιμοποιείται ευρέως στην θεραπεία MDS. Παρ’ολα αυτα, η επίδραση της AZA στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών και συγκεκριμένα στα μεσεγχυματικά βλαστικά κυτταρα δεν έχει μελετηθεί εκτενώς. Τα εξωκυττάρια κυστίδια ανήκουν στην οικογένεια των μεμβρανικών κυστιδίων, αποτελούνται από μια φωσφωλιπιδική διπλοστοιβάδα και εκκρίνονται στο εξωκυττάριο περιβάλλον από περίπου όλα τα κύτταρα. Τα εξωκυττάρια κυστίδια διαχωρίζονται σε 3 κύριες τάξεις οι οποίες βασίζονται στην δημιουργία και το μέγεθος των κυστιδίων: αποπτωτικά σωμάτια, μικροκυστίδια και εξωσώματα.
Σκοπός της εργασίας: Ο στόχος της εργασίας είναι η απομόνωση, η ποσοτικοποίηση και η επαλήθευση της παρουσίας των εξωσωμάτων τα οποία προέρχονται από τα μεσεγχυματικα βλαστικά κύτταρα μυελού των οστών (BM-MSCs) από ασθενείς με MDS και από υγιής δότες. Επίσης, στόχος ήταν η διερεύνηση των επιπτώσεων που έχει η θεραπεία με ΑΖΑ στα φαινοτυπικά, πολλαπλασιαστικά και διαφοροποιητικά χαρακτηριστικά των BM-MSCs προερχόμενα από ασθενείς με MDS-υψηλου κινδύνου και από υγιής δότες. Επιπρόσθετα, ακόμη ένας στόχος είναι η μελέτη της ενσωμάτωσης των εξωσωμάτων προερχόμενα από MSCs από ασθενείς με MDS και Υγιών δοτών με CD34+ και η επίδραση που έχει στην κλωνογονική ικανότητα των Αιμοποιητικών Βλαστικών Κυττάρων και συνεπώς την αιμοποιήση.
Υλικά και Μέθοδοι: BM-MSCs από ασθενείς με ΜΔΣ (ν=4), εκ των οποίων 2 είχαν μελετηθεί επίσης πριν και μετά την θεραπεία με ΑΖΑ, και από υγιής δότες (ν=3) καλλιεργήθηκαν ex vivo για 3 κυτταρικά περάσματα (P-passages) και χαρακτηρίστηκαν φαινοτυπικά μέσω κυτταρομετρητή ροής. Τα αναπτυξιακά χαρακτηριστικά των BM-MSCs αξιολογήθηκαν με την βοήθεια της μεθόδου του μεθυλο-τριαζολυλ-τετραζολίου (MTT), και η αξιολόγηση της διαφοροποιητικής ικανότητας πραγματοποιήθηκε με ιστοχημικές χρώσεις (Alizarin Red και Von Kossa για τα οστεοκύτταρα, Oil Red O για τα λιποκύτταρα) και με εκτίμηση της έκφρασης γονιδίων ειδικών για την οστεογένεση (ALP, OSC, DLX5, RUNX2) και τη λιπογένεση (PPARG, CEBPA).Κατα την διάρκεια της έρευνας αυτής καθιερώθηκε το πρωτόκολο απομόνωσης εξωσωμάτων απο την κυτταρική σειρά MDA-MB-231 μέσω διαδοχικών βημάτων υπερφυγοκέντρησης και ποσοτικοποιήθηκαν με την βοήθεια της μεθόδου BCA. Ακόμη, η επαλήθευση της παρουσίας των εξωσωμάτων πραγματοποιήθηκε μέσω της μεθοόδου Western για τις πρωτείνες αναφοράς Alix και CD9. Για την μελέτη επίδρασης των εξωσωμάτων στην κλωνογονική ικανότητα των Αιμοποιητικών Βλαστικών Κυττάρων πραγματοποιήθηκε συν-καλλιέργεια μεταξύ εξωσωμάτων από 3 τυχαία δείγματα BM-MSCs μαζί με CD34+ κύτταρα και παρατηρήθηκε ο αριθμός των αποικειών που δημιουργήθηκαν.
Αποτελέσματα: Μέχρι στιγμής τα αποτελέσματα μας έχουν δείξει ότι τα καλλιεργούμενα MSCs από MDS-ασθενείς πριν και μετά την θεραπεία με ΑΖΑ παρουσίασαν παρόμοια μορφολογικά χαρακτηριστικά συγκριτικά με τα MSCs υγιών δοτών, καθώς και οι δύο διατήρησαν το χαρακτηριστικό σχήμα του ινοβλάστη. Η μελέτη των ανοσοφαινοτυπικών χαρακτηριστικών των MDS-MSCs έδειξε ότι εκφράζουν τους αναμενόμενους δείκτες επιφάνειας που αναμένονται στα MSCs, με καμιά διαφορά πριν και μετά την θεραπεία με ΑΖΑ. Ακόμη, κάποια πρώιμα αποτελεσματα υποδεικνύουν ότι η πολλαπλασιαστική ικανότητα των MDS-MSC πριν και μετά την θεραπεία με ΑΖΑ in vivo φαίνεται να είναι παρόμοια, σε αντίθεση με την θεραπεία με ΑΖΑ in vitro η οποία φαίνεται να μειώνει το δυναμικό πολλαπλασιασμού των MDS-MSC. Η ικανότητα διαφοροποίησης των MDS-MSC προς οστεοκύτταρα και λιποκύτταρα όπως έχει φανεί στις χρώσεις δεν παρουσίασε κάποια μορφολογική διαφορά μεταξύ πριν και μετά την θεραπεία με ΑΖΑ. Παρ’ όλα αυτά, η έκφραση γονιδιών των MDS-MSC πριν την θεραπεία με ΑΖΑ έδειξε ότι τα γονίδια σχετιζόμενα με την λιπογένεση ήταν αυξημένα, ενώ η έκφραση των γονιδίων σχετιζόμενα με την οστεογένεση ήταν παρόμοια με την έκφραση των MDS-MSC μετά την θεραπεία με ΑΖΑ, αλλά όχι στατιστικά σημαντικά. Από την άλλη πλευρά, η εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης για τα συγκεκριμένα γονίδια έδειξε ότι τα BM-MSC από υγιείς δότες υπερέχουν στην ικανότητά τους να διαφοροποιούνται σε λιποκύτταρα και οστεοκύτταρα σε σύγκριση με τα MDS-MSCs ανεξάρτητα από τη θεραπεία με ΑΖΑ. Επιπλέον, κατά τη διάρκεια της μελέτης, καθιερώθηκε η απομόνωση των εξωσωμάτων που προέρχονται από την κυτταρική σειρά MDA-MB-231 χρησιμοποιώντας υπερφυγοκέντρηση και τα απομονωμένα εξωσώματα επιβεβαιώθηκαν με την έκφραση των πρωτεϊνών Alix και CD9. Συγκαλλιέργειες εξωσωμάτων που προέρχονται από τυχαία δείγματα MSCs με κύτταρα CD34+ υγιών δοτών έδειξαν ότι η ενσωμάτωση εξωσωμάτων σε κύτταρα CD34 + δεν είχε σημαντική επίδραση στην κλωνογονική ικανότητα των κυττάρων CD34+ σε σύγκριση με τον αριθμό των αποικιών σχηματισμού δειγμάτων ελέγχου CD34+ (απουσία εξωσωμάτων).
Συμπεράσματα: Συμπερασματικά, όλα τα πειράματα είναι ακόμη σε εξέλιξη και χρειάζονται πολλά ακόμη για να επιτευχθεί ένα έγκυρο αποτέλεσμα, αλλά μέχρι στιγμής, φαίνεται ότι η θεραπεία με AZA in vivo με την παρουσία του αυξητικού παράγοντα (FGF-2) δεν έχει στατιστικά σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των MDS-MSC, αυξάνει το δυναμικό διαφοροποίησης των MDS-MSC σε λιποκύτταρα και διατηρεί το οστεογονικό δυναμικό των MSC σε σύγκριση με το MDS-MSC πριν από τη θεραπεία με AZA. Περαιτέρω έρευνα σε MDS-MSCs πριν και μετά τη θεραπεία με Azacytidine χρειάζεται για να καταστήσει τον μηχανισμό δράσης του AZA πιο κατανοητό ενώ θα παρέχει νέα δεδομένα για την παθοφυσιολογία των MDS, οδηγώντας έτσι σε μια καλύτερη θεραπευτική προσέγγιση.
Επιπλέον, επιτεύχθηκε η τυποποίηση της απομόνωσης εξωσωμάτων, της ποσοτικοποίησης και της επαλήθευσης της παρουσίας. Ωστόσο, παρόλο που τα εξωκυτταρικά κυστίδια έχουν γίνει το επίκεντρο μεγάλου ενδιαφέροντος, εξακολουθούν να υπάρχουν σημαντικά εμπόδια που πρέπει να ξεπεραστούν ώστε να βελτιστοποιηθεί η κλινική τους χρήση.
(EL)
Introduction: Myelodysplastic syndromes (MDS) are clonal disorders of the hematopoietic stem cell characterized by ineffective bone marrow hematopoiesis and increased risk for leukemic evolution. However, MDS pathogenesis is not restricted to the Hematopoietic Stem Cell (HSC) compartment, an abnormal BM microenvironment has been reported to contribute to BM failure in MDS through defective support of hematopoiesis. Mesenchymal Stem Cells (MSCs) are key components of the Bone Marrow niche. MDS derived MSCs (MDS-MSCs) have been shown to hold intrinsic functional defects and an inability to sustain normal hematopoiesis. It has been shown that DNA methylation occurs at a high frequency in MDS and that gene reactivation by hypo-methylating agents may have a positive impact on patients' outcome. The methyl transferase inhibitor 5-Azacitidine (ΑΖΑ) is widely used for the treatment of MDS; however, the effect of AZA on patients' BM microenvironment and specifically on the MSC compartment has not been extensively studied. Extracellular Vesicles (EVs) are a family of membrane vesicles containing a phospholipid bilayer and are secreted in the extracellular environment by most if not all cells. EVs can be separated into three major classes based on their biogenesis and their size: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.
Aim of the study: The aim of the study was the isolation, quantification and verification of the presence of exosomes derived from BM-MSCs from both MDS patients and Heathy donors. Also, another aim was to investigate the effect of AZA treatment on phenotypic, proliferative and differentiation characteristics of BM-MSC derived from High Risk-MDS patients compared with Healthy Donors (HD). Moreover, we wanted to study the incorporation of exosomes derived from MDS-MSCs and HD with CD34+ and observe their effect on clonogenic potentials of Hematopoietic Stem Cells and subsequently hematopoiesis.
Materials and Methods: BM-MSCs from MDS patients (n=4), of which 2 were studied also before and after 4 cycles of AZA treatment, and HD (n=3) were ex vivo expanded and re-seeded for a total of 3 passages and phenotypically characterized by flow cytometry. The proliferative potential of BM-MSCs was evaluated via the MTT method, the potential of MSCs to differentiate into adipocytes and osteocytes was evaluated via histochemical stainings (Alizarin Red and Von Kossa for osteocytes, and Oil Red O for adipocytes) and through the expression levels of specific genes (ALP, OSC, DLX5, RUNX-2 for osteocytes and PPARγ and CEBPa for adipocytes). Exosomes from MDA-MB-231 were isolated following consecutive steps of ultracentrifugation and were quantifies using BCA assay. The presence of exosomes was confirmed via Western Blot for two reference proteins Alix and CD9. Also, to examine incorporation of exosomes derived from MDS-MSCs (both before and after AZA treatment) and HD into CD34+ and their effect on their clonogenic potential and subsequently to hematopoiesis.
Results: Thus far, our results have shown that cultured MSCs from MDS patients before and after treatment with AZA exhibited similar morphological characteristics compared with MSCs from HD, as both preserve the characteristic spindle-shaped fibroblast-like morphology. The immunophenotypic characteristics of MSCs from MDS patients showed the expression of the typical mesenchymal surface markers, with no differences detected in their expression before and after AZA treatment. In addition, some early results indicated that the proliferation potential of MDS-MSC before and after AZA treatment in vivo appeared to be similar, in contrast with AZA treatment in vitro which reduces the proliferative potential of cultured MDS-MSCs. The differentiation capacity of MDS-MSCs into osteocytes and adipocytes as shown by the stains did not exhibited any morphological difference before and after AZA treatment. However, the gene expression of MDS-MSCs after AZA treatment showed that adipogenesis-related genes were increased, while osteogenesis-related genes were similar with the MDS-MSCs before AZA, but not statistically significant. On the other hand, estimation of the expression levels for the specific genes shown that BM-MSCs from HD excel in their ability to differentiate into adipocytes and osteocytes compared with MDS-MSCs regardless of ΑΖΑ treatment. Moreover, during the study, the isolation of exosomes derived from the MDA-MB-231 cell line using ultracentrifugation was standardized and the isolated exosomes were confirmed by the expression of proteins Alix and CD9. Co-cultures of exosomes derived from random MSCs samples into CD34+ cells indicated that the incorporation of exosomes into CD34+ cells had no important effects on the clonogenic capacity of CD34+ cells comparing with the number of forming colonies of CD34+ control samples (without exosomes).
Conclusion: Consequently, all experiments are still ongoing and many more are needed in order to get a valid result, but thus far, it appears that AZA treatment in vivo has no statistically significant effects on MSCs proliferation, it increases the differentiation potential of MSCs into adipocytes and maintains the osteogenic potential of MSCs compared with MDS-MSC before AZA treatment. Further research in MDS-MSCs before and after the treatment with Azacytidine in needed to make the action mechanism of AZA more understandable while providing new data on the pathophysiology of MDS, thus leading to a better therapeutic approach. Moreover, the standardization of exosome isolation, quantification and presence verification was achieved. However, even though EVs have become the focus of great interest, there are still important obstacles to overcome so as to optimize their clinical use.
(EN)
University of Crete
