Το γονίδιο Sox2 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που περιέχει την περιοχή HMG-box,
σαν δομική μονάδα πρόσδεσης στο DNA. Θεωρείται ένα από τα γονίδια-κλειδιά με
πρωταγωνιστικό ρόλο στην ρύθμιση της πλειοδυναμίας της πρώιμης εμβρυικής ανάπτυξης
και στο καθορισμό της κυτταρικής μοίρας στην διάρκεια της ανάπτυξης και της ομοιόστασης.
Κατά την διάρκεια της πρώιμης ανάπτυξης, το γονίδιο Sox2 είναι απαραίτητο για την
δημιουργία της επιβλάστης. Όμως ο ρόλος του στα βλαστικά κύτταρα δεν είναι ακόμη
γνωστός. Σε αυτήν την μελέτη δημιουργήσαμε μια χειρουργική απαλοιφή της λειτουργίας του
Sox2 στην επιβλάστη χρησιμοποιώντας ένα επαγόμενο με αναστροφή Sox2 αλλήλιο. για την
μετάδοση της επαγωγής, η μέθοδος του επαγόμενου με αναστροφή αλληλίου για την
κατασκευή επαγόμενων αλληλίων βασίζεται σε μια βελτιστοποιημένη αναστρεφόμενη κασέτα
παγίδευσης γονιδίων (Conditional by Inversion - COIN). Η κασέτα COIN περιλαμβάνει ένα
ζευγάρι βελτιστοποιημένα σήματα πολυαδενυλίωσης για 3΄ μάτισμα, αλλά εισάγεται στην μη
μεταγραφόμενη αλυσίδα του DNA του γονιδίου-στόχου, με αποτέλεσμα να μην
μεταβάλλεται η μεταγραφή του γονιδίου, παρά μόνο όταν αναστρέφεται η κασέτα από το
ένζυμο ανασυνδυασμού CRE. Για την εφαρμογή της τεχνολογίας του COIN σε όλα τα γονίδια
που εκφράζουν πρωτεΐνες, το στοιχείο COIN έχει κατασκευαστεί μέσα σε ένα τεχνιτό
ιντρόνιο, επιτρέποντας την εισαγωγή της κασέτας μέσα σε ένα εξώνιο. Συνεπώς, θεωρητικά
η μέθοδος COIN θα πρέπει να είναι εφαρμόσιμη και σε γονίδια που αποτελούνται από ένα
εξώνιο. Για να ελέγξουμε αυτήν την ιδέα κατασκευάσαμε ένα αλλήλιο του γονιδίου Sox2. Το
συγκεκριμένο γονίδιο που αποτελείται από ένα εξώνιο προσφέρει σχεδιαστικές προκλήσεις
αφού ο εγγυής υποκινητής και η περιοχή κωδικοποίησης της πρωτεΐνης αποτελούν ένα CpG
νησιδίο και γεφυρώνονται από ένα επικαλυπτόμενο μετάγραφο, Sox2ot, που περιλαμβάνει
και το mmu-miR1897. Σε αυτήν την εργασία, αποδεικνύουμε ότι παρόλη την διατάραξη του
CpG νησιδίου από το ιντρόνιο της κασέτας COIN, το Sox2COIN αλλήλιο είναι φαινοτυπικά ίδιο
με το αντίστοιχο άγριου τύπου αλλήλιο, και επίσης δεν παρεμβαίνει στην έκφραση του
Sox2ot και mmu-miR1897. Επιπλέον, το ανεστραμμένο COIN αλλήλιο του γονιδίου, Sox2INV
είναι λειτουργικά ανενεργό, καθότι ομοζυγωτά ζώα εμφανίζουν τον ίδιο φαινότυπο όπως το
Sox2ßgeo/ßgeo, ένα πολύ καλά χαρακτηρισμένο Sox2 ανενεργό αλλήλιο. Τέλος το πλεονέκτημα
της πλήρους ενσωμάτωσης του γονιδίου-μάρτυρα eGFP στο αλλήλιο COIN αποδεικνύεται
από το γεγονός του ότι η έκφραση του αντικατοπτρίζει την έκφραση του Sox2 γονιδίου. Η
αναστροφή του Sox2COIN αλλήλιου στην επιβλάστη παράγει φυσιολογικά ετεροζυγωτά
Sox2INV/+ ενήλικα ζώα και Sox2INV/+(Η) απλοανεπαρκή μεταλλαγμένα έμβρυα. Sox2INV/+ (Η)
απλοανεπαρκή και επαγόμενα Sox2INV/mosaic έμβρυα παρουσιάζουν προβλήματα στην
δημιουργία των κοιλιών κατά την ανάπτυξη της καρδιάς, υποφέρουν από βραδυκαρδία, από
δυσμορφία του μυοκαρδίου και αιμορραγία και πεθαίνουν περίπου την εμβρυική ημέρα Ε11
(Ε11). Sox2INV/+(Η) απλοανεπαρκή και επαγόμενα Sox2INV/mosaic έμβρυα παρουσιάζουν
υδροκεφαλισμό, επιτείνουσα και παρεκκλίνουσα μετανάστευση των κυττάρων της νευρικής
ακρολοφίας στα εμπροστορυνική περιοχή, χωρίς καμία επίδραση στην δημιουργία των
κρανιακών νεύρων, παρά μόνο σε ανώμαλη εμπροστορυνική ανάπτυξη. Τα αποτελέσματα
μας δείχνουν ότι το Sox2 δρα ως ροοστάτης της μετατροπής κυττάρων με επιθηλιακό σε
μεσεγχυματικό χαρακτήρα κατά την ανάπτυξη της νευρικής ακρολοφίας.
(EL)
Sox2 encodes a transcription factor that harbours a DNA binding HMG domain. It is
considered one of the key gene players for the regulation of pluripotency and early
embryonic development, and a determinant of cell fate during development and
homeostasis. During early development, Sox2 is required for the formation of the epiblast.
However, its role in stem cells is still elusive. Here, we performed a surgical ablation of Sox2
in the epiblast using a novel Conditional by Inversion Sox2 allele (Sox2COIN). The Conditional
by Inversion (COIN) method for engineering conditional alleles relies on an invertible
optimized gene trap-like element, the COIN module, for imparting conditionality. The COIN
module contains an optimized 3’ splice site-polyadenylation signal pair, but is inserted
antisense to the target gene and therefore does not alter transcription, until it is inverted by
Cre recombinase. In order to make COIN applicable to all protein-coding genes, the COIN
module has been engineered within an artificial intron, enabling insertion into an exon.
Therefore, theoretically, the COIN method should be applicable to single exon genes, and to
test this idea we engineered a COIN allele of Sox2. This single exon gene presents design
challenges, in that its proximal promoter and coding region are entirely contained within a
CpG island, and are also spanned by an overlapping transcript, Sox2Ot, which contains
mmu-miR1897. Here, we show that despite disruption of the CpG island by the COIN
module intron, the COIN allele of Sox2 (Sox2COIN) is phenotypically wild type, and also does
not interfere with expression of Sox2Ot and miR1897. Furthermore, the inverted COIN allele
of Sox2, Sox2INV is functionally null, as homozygotes recapitulate the phenotype of
Sox2ßgeo/ßgeo mice, a well-characterized Sox2 null. Lastly, the benefit of the eGFP marker
embedded in the COIN allele is demonstrated as it mirrors the expression pattern of Sox2.
Epiblast-inversion of the Sox2COIN allele generates normal heterozygote Sox2INV/+ adult
animals and Sox2INV/+ (H) haploinsufficient mutant embryos. Sox2INV/+ (H) haploinsufficient and
Sox2INV/mosaic embryos exhibit heart-looping defects, suffer from bradycardia, myocardium
malformation and bleeding and die around E11. Sox2INV/+(H) haploinsufficient and
Sox2INV/mosaic embryos exhibit hydrocephaly, exacerbated and aberrant migration of neural
crest cells in the branchial arches and the frontonasal region, with no effect on cranial nerve
formation but abnormal frontonasal development. We propose that Sox2 acts as a rheostat
of the epithelial to mesenchymal transition during neural crest development.
(EN)
University of Crete
