Οι κύριοι ερευνητικοί στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να
απαντηθούν ερωτήματα που αφορούν στη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που
ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στο μεταβολισμό των
λιποπρωτεϊνών στο ήπαρ και να τακτοποιηθούν νέες μοριακές στρατηγικές για την
αύξηση των επιπέδων της HDL στο πλάσμα.
Ο μεταβολισμός των λιποπρωτεϊνών περιλαμβάνει τη μεταφορά λιπιδίων,
ιδιαίτερα χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων, από το έντερο και το ήπαρ προς τους
περιφερικούς ιστούς και αντίστροφα από τη περιφέρεια πίσω στο ήπαρ (αντίστροφη
μεταφορά χοληστερόλης). Στα μονοπάτια αυτά εμπλέκονται πολλές πρωτεΐνες,
συμπεριλαμβανομένων των απολιποπρωτεϊνών, μεμβρανικοί μεταφορείς, ένζυμα του
πλάσματος και υποδοχείς λιποπρωτεϊνών. Η λιποπρωτεινική λιπάση (LPL) παίζει
σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών καθώς καταλύει την υδρόλυση
των τριγλυκεριδίων που βρίσκονται στα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια πλούσια σε
τριγλυκερίδια, όπως είναι τα χυλομικρά και η VLDL (very low density lipoprotein).
Τα λιπαρά οξέα που ελευθερώνονται στους ιστούς αποθηκεύονται στο λιπώδη ιστό ή
χρησιμοποιούνται για παραγωγή ενέργειας από διάφορους ιστούς. Η LPL εκφράζεται
σε υψηλά επίπεδα κυρίως στο λιπώδη ιστό και τους μύες, αλλά ανιχνεύεται σε
χαμηλά επίπεδα σε άλλους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου και του ήπατος. Ο ρόλος
της LPL στο ενήλικο ήπαρ είναι αμφιλεγόμενος εξαιτίας των χαμηλών επιπέδων
έκφρασης της σ αυτόν τον ιστό. Παρ’ όλα αυτά, πρόσφατες μελέτες σε μοντέλα
ποντικών στα οποία υπερκεράζεται ή απαλείφεται η LPL στο ήπαρ, έχουν αναδείξει
τη σημαντικότητα αυτού του ενζύμου στο μεταβολισμό των λιπιδίων και της
γλυκόζης.
Στην Ενότητα Ι, χαρακτηρίσαμε το μηχανισμό που ρυθμίζει την έκφραση του
γονιδίου LPL του ανθρώπου στα ηπατικά κύτταρα σε μεταγραφικό επίπεδο. Αρχικά
κλωνοποιήσαμε τον υποκινητή της ανθρώπινης LPL και πραγματοποιήσαμε ανάλυση
των απαλοιφών του υποκινητή της LPL με πειράματα παροδικής διαμόλυνσης
κυττάρων HepG2. Παρατηρήσαμε ότι η κοντινή περιοχή -109/-28 του υποκινητή
είναι σημαντική για τη βασική ηπατική ενεργότητα του υποκινητή του γονιδίου LPL.
Με βιοπληροφορική ανάλυση αυτής της περιοχής εντοπίστηκε μια πιθανή θέση
πρόσδεσης (-47/-40) για τον παράγοντα FOXA2 (HNF3β), ο οποίος παίζει σημαντικό
ρόλο στην ομοιόσταση των λιπιδίων και της γλυκόζης. Αποσιώπηση της έκφρασης της ενδογενούς πρωτεΐνης FOXA2 στα κύτταρα HepG2 (χρησιμοποιώντας ένα ειδικό
siRNA), οδήγησε σε μείωση των επιπέδων πρωτεΐνης και mRNA του γονιδίου LPL.
Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης και αλληλεπίδρασης DNA-πρωτεϊνών
έδειξαν ότι ο μεταγραφικός παράγοντας FOXA2 προσδένεται στην κοντινή περιοχή -
141/-10 του υποκινητή της LPL. Αυτό το ρυθμιστικό στοιχείο χαρακτηρίστηκε
περαιτέρω με μεταλλαξιγένεση. Μεταλλάξεις πέντε βάσεων στη θέσης πρόσδεσης
του FOXA2 (-47/-40) κατάργησαν την πρόσδεση του FOXA2 στη θέση αυτή και
μείωσαν σημαντικά τόσο τη βασική ενεργότητα του υποκινητή της LPL όσο και την
ενεργοποίηση του υποκινητή από τον παράγοντα FOXA2. Στη συνέχεια, μελετήσαμε
την επίδραση της ινσουλίνης στην ηπατική ρύθμιση του γονιδίου LPL στα κύτταρα
HepG2. Παρατηρήσαμε ότι η ινσουλίνη αύξησε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της
ΑΚΤ και οδήγησε σε αποκλεισμό του FOXA2 από τον πυρήνα, το οποίο στη
συνέχεια προκάλεσε μείωση των επιπέδων mRNA του γονιδίου LPL και της
ενεργότητας του υποκινητή. Με βάση αυτά τα ευρήματα, προτείνουμε ένα νέο ρόλο
του παράγοντα FOXA2 στη ρύθμιση του γονιδίου LPL του ανθρώπου από την
ινσουλίνη, στα ηπατικά κύτταρα.
Στην Ενότητα ΙΙ, διερευνήσαμε το μηχανισμό ρύθμισης του γονιδίου LPL
του ανθρώπου από τους πυρηνικούς υποδοχείς LXR (Liver X Receptors) στα ηπατικά
κύτταρα. Προηγούμενες μελέτες σε μοντέλα ποντικών είχαν δείξει ότι η έκφρασή του
γονιδίου LPL στο ήπαρ επάγεται ισχυρά από δίαιτες υψηλές σε χοληστερόλη ή από
συνθετικούς LXR αγωνιστές που ενεργοποιούν τους πυρηνικούς υποδοχείς LXR και
RXR (Retinoid X Receptor). Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, δείξαμε ότι επώαση
κυττάρων HepG2 ή πρωτογενών ηπατοκυττάρων ποντικού με τον συνθετικό LXR
αγωνιστή T0901317 αύξησαν την έκφραση του γονιδίου της LPL τόσο σε επίπεδό
RNA όσο και πρωτεϊνών. Επίσης η υπερέκφραση του ετεροδιμερούς LXRα/RXRα σε
κύτταρα HepG2 παρουσία των συνδετών τους, ενεργοποίησε ισχυρά τον υποκινητή -
883/+39 της ανθρώπινης LPL. ανάλυση των απαλοιφών του υποκινητή της LPL
έδειξαν ότι η ελάχιστη περιοχή που απαιτείται για την ενεργοποίηση από τα
ετεροδιμερή LXRα/RXRα ήταν η -109/-28, η οποία περιλαμβάνει τη θέση πρόσδεσης
του FOXA2. Ενδιαφέρον παρουσιάζει, το γεγονός ότι οι υποδοχείς LXRα και RXRα
προσδένονται πολύ ασθενικά στον υποκινητή του γονιδίου LPL, όπως διαπιστώθηκε
με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης, υποδεικνύοντας ότι επιπλέον
παράγοντες απαιτούνται για την δράση των LXR. Αποσιώπηση της έκφρασης της
ενδογενούς πρωτεΐνης FOXA2 στα κύτταρα HepG2 και σε πρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού, χρησιμοποιώντας ένα ειδικό siRNA, προκάλεσε δραματική μείωση της
επαγωγής της έκφρασης του γονιδίου LPL από τον συνδέτη του LXR, T0901317, σε
επίπεδο πρωτεΐνης και mRNA. Αξιοσημείωτη είναι η διαπίστωση ότι η ινσουλίνη, η
οποία απενεργοποιεί τον παράγοντα FOXA2 μέσω πυρηνικού του αποκλεισμού,
μείωσε την επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου LPL από τις οξυστερόλες,
υποδεικνύοντας της σημαντικότητα του παράγοντα FOXA2 στην ομοιόσταση των
λιπιδίων στο ήπαρ. Έπειτα, παρατηρήσαμε ότι η ταυτόχρονη υπερέκφραση της
πρωτεΐνης FOXA2 και των LXRα/RXRα, παρουσία των συνδετών τους,
ενεργοποίησε τον υποκινητή της LPL κατά έναν συνεργατικό τρόπο.
Καταστρέφοντας τη θέση πρόσδεσης του παράγοντα FOXA2 (με τις μεταλλάξεις
που αναφέρθηκαν παραπάνω), αναστάλθηκε σημαντικά η συνεργατική ενεργοποίηση
του υποκινητή της LPL από τους πυρηνικούς υποδοχείς LXRα/RXRα και τον
παράγοντα FOXA2.Τέλος, πραγματοποιήσαμε πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης
και δοκιμασίες GST pull down και δείξαμε ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες FOXA2
και LXR/RXR αλληλεπιδρούν φυσικά in vivo και in vitro. Μια εκτεταμένη DBD
(DNA binding domain) περιοχή του υποδοχέα LXRα απαιτείται για τη τις φυσικές
αλληλεπιδράσεις με τουλάχιστον μία από τις δύο περιοχές ενεργοποίησης
(transactivation domains) του FOXA2. Συνοψίζοντας, τα ευρήματα των Ενοτήτων Ι
και ΙΙ υποδεικνύουν ότι ή νέα θέση πρόσδεσης του παράγοντα FOXA2 στον
υποκινητή της LPL λειτουργεί σαν ένα νέο ρυθμιστικό στοιχείο LXRE, το οποίο
διευκολύνει την επαγωγή του γονιδίου LPL από τις οξυστερόλες μέσω του
παράγοντα FOXA2. Μέσω ενός σηματοδοτικού μονοπατιού ινσουλίνης- AKTFOXA2-
LPL η υπερέκφραση της LPL στο ήπαρ εμποδίζεται σε συνθήκες περίσσειας
χοληστερόλης, προστατεύοντας τον ιστό αυτό από τις τοξικές δράσεις της LPL.
Στην Ενότητα ΙΙΙ, εστιαστήκαμε στην ρύθμιση γονιδίων που συμμετέχουν στη
βιογένεση και αναδιαμόρφωση της HDL από τους μεταγραφικούς παράγοντες
FOXA2 και LXRs στα ηπατικά κύτταρα. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι σε
ποντίκια ετερόζυγα για τον παράγοντα FOXA2, τα επίπεδα της HDL στο πλάσμα
είναι μειωμένα. Με βιοπληροφορική ανάλυση, εντοπίστηκαν πιθανές θέσεις
πρόσδεσης για τον παράγοντα FOXA2 που βρίσκονται κοντά σε χαρακτηρισμένα
ρυθμιστικά στοιχεία LXRE, στους υποκινητές των γονιδίων ABCG1, LIPC και
CETP. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, παρατηρήσαμε ότι η επώαση
κυττάρων HepG2 και πρωτογενών ηπατοκυττάρων ποντικού με τον συνθετικό LXR
αγωνιστή , T0901317, προκάλεσε ισχυρή επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων ABCG1, ABCG5, ABCG8 και CETP, σε επίπεδο mRNA. Απενεργοποίηση του
παράγοντα FOXA2, μέσω siRNA αποσιώπησης είτε μέσω επίδρασης με ινσουλίνη σε
πρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού ή σε κύτταρα HepG2, μείωσε τα βασικά επίπεδα
mRNA αλλά και την επαγωγή των ABCG5 και ABCG8 γονιδίων, από τον αγωνιστή
T0901317, υποδεικνύοντας ότι ο FOXA2 έχει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση
αυτών των μεταφορέων λιπιδίων από τους συνδέτες των πυρηνικούς υποδοχείς LXR.
Πραγματοποιώντας πειράματα παροδικής διαμόλυνσης σε κύτταρα HepG2
παρατηρήσαμε ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης FOXA2 ή των υποδοχέων
LXRα/RXRα οδήγησε σε αύξηση της ενεργότητας των υποκινητών των γονιδίων
ABCG5 και ABCG8. Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, αποσιώπηση της
έκφρασης της ενδογενούς πρωτεΐνης LXRα ή LXRβ στα κύτταρα HepG2, μέσω
λεντιïών που εκφράζουν ειδικά shRNAs για κάθε ισομορφή των LXR, μείωσε τα
επιπέδων mRNA των γονιδίων ABCG5 και ABCG8. Επιπλέον, η ταυτόχρονη
υπερέκφραση των πρωτεϊνών FOXA2 και LXRα/RXRα, παρουσία των συνδετών
τους ενεργοποίησε κατά έναν συνεργατικό τρόπο τον υποκινητή του γονιδίου
ABCG8, αλλά όχι τον υποκινητή του γονιδίου ABCG5. Αντίθετα, ο FOXA2
ανέστειλε την επαγωγή του υποκινητή του γονιδίου ABCG5 από τους LXRs και τις
οξυστερόλες στα κύτταρα HepG2, υποδεικνύοντας την ύπαρξη απομακρυσμένων
ρυθμιστικών στοιχείων και μεταγραφικών παραγόντων, τα οποία ίσως συνδέονται με
λούπες του DNA και με αυτόν τον τρόπο ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων
ABCG5 και ABCG8. Τα ευρήματα αυτά έρχονται σε συμφωνία με την συνεργατική
ενεργοποίηση του υποκινητή της LPL από τους πυρηνικούς υποδοχείς LXRα/RXRα
και τον παράγοντα FOXA2, όπως περιγράφηκε παραπάνω.
Η κατανόηση σε βάθος των μηχανισμών, με τους οποίους συνδέονται τα
μεταβολικά μονοπάτια λιπιδίων και γλυκόζης στο ήπαρ από παράγοντες όπως ο
FOXA2 είναι ιδιαίτερα σημαντική για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών
στρατηγικών για την αύξηση των επιπέδων της HDL και την προστασία ασθενών με
μεταβολικές ασθένειες, όπως η καρδιαγγειακή νόσος, ο διαβήτης, οι δυσλιπιδαιμίες
και το μεταβολικό σύνδρομο.
(EL)
The aim of the present PhD thesis was to investigate the molecular mechanisms
that control the expression of genes that are involved in lipoprotein metabolism and to
identify new molecular approaches that increase HDL levels in plasma.
Lipoprotein metabolism involves the transport of lipids, particularly cholesterol
and triglycerides, from intestine and liver to peripheral tissues and from periphery
back to the liver (reverse cholesterol transport) and is facilitated by numerous proteins
including apolipoproteins, membrane transporters, plasma enzymes and lipoprotein
receptors. Lipoprotein lipase (LPL) plays a critical role in lipoprotein remodeling by
catalyzing the hydrolysis of triglycerides (TGs) present in TG-rich lipoprotein
particles such as very low density lipoprotein (VLDL) and chylomicrons (CMs) to
free fatty acids for the subsequent storage in adipose tissue or utilizations for the
production of energy by various tissues. LPL is expressed primarily in the adipose
tissue but it is also expressed at lower levels in other tissues including the liver. The
role of LPL in the adult liver has been controversial due its low levels of expression
but recent studies in mouse models of liver LPL overexpression or deficiency have
revealed important new roles of the enzyme in glucose and lipid metabolism.
In Part I we characterized the mechanism that controls the expression of human
LPL in hepatic cells at the level of transcription. First, we cloned the human LPL
promoter and performed a deletion analysis using transactivation assays in human
hepatoblastoma HepG2 cells. We revealed that the proximal region -109/-28 is
important for basal hepatic LPL promoter activity. An in silico analysis of this region
showed that it harbors a putative binding site, at position -47/-40, for the hepatic
transcription factor forkhead box A2 (FOXA2) or Hepatocyte Nuclear factor 3β
(HNF-3β), shown previously to play important roles in lipid and glucose homeostasis.
Silencing of endogenous FOXA2 expression in HepG2 cells (using a specific siRNA)
reduced the LPL mRNA and protein levels. Direct binding of FOXA2 to the novel
binding site was established using chromatin immunoprecipitation assays, ex vivo and
DNA affinity precipitation assays in vitro. This element was further characterized by
site directed mutagenesis and it was found that five nucleotide substitutions in the
FOXA2 site abolished the binding of FOXA2 and reduced the basal activity of the
LPL promoter and the FOXA2-mediated transactivation. Next, we studied the effect of insulin on the hepatic regulation of the LPL gene in HepG2 cells and we showed
that insulin induces the phosphorylation of AKT and the nuclear export of FOXA2
causing a reduction in the LPL mRNA levels and promoter activity. Based on these
findings, we proposed a novel role of FOXA2 in the regulation of the human LPL
gene in hepatic cells by insulin.
In Part II we elucidated the mechanism of regulation of the human LPL gene by
Liver X Receptors (LXR) in hepatic cells. Previous studies in mice had shown that the
expression of LPL gene in the liver is strongly induced by high fat diets and synthetic
agonists that activate the nuclear receptors LXR and RXR (Retinoid X Receptor). In
agreement with these findings, we showed that treatment of HepG2 cells or primary
mouse hepatocytes with the LXR synthetic agonist T0901317 upregulated the
expression of LPL gene in mRNA and protein levels. Moreover, the nuclear receptors
LXRα and RXRα transactivated strongly the human LPL promoter in response to
their ligands in HepG2 cells and deletion analysis of the human LPL promoter
established that the minimal region required for LXR/RXR transactivation was the -
109/-28, which involves the FOXA2 binding site. Interestingly, we demonstrated very
weak binding of nuclear receptors LXRα and RXRα to the proximal human LPL
promoter, using chromatin immunoprecipitation assays, suggesting that additional
factors are required for LXR action. Silencing of the endogenous FOXA2 gene using
a specific siRNA in HepG2 cells and in mouse primary hepatocytes caused an
inhibition of the oxysterol-inducible expression of LPL gene at both the mRNA and
protein levels. Importantly, insulin, which inactivates FOXA2 via its nuclear
exclusion, reduced the oxysterol-inducible expression of LPL gene, indicating the
importance of FOXA2 in the lipid homeostasis in the liver. Next, we found that
FOXA2 and ligand-activated LXRα/RXRα transactivated the human LPL promoter in
a synergistic fashion. The mutations in the FOXA2 binding site (-47/-40) inhibited the
synergistic transactivation of the LPL promoter by FOXA2 and LXRα/RXRα. Finally,
we performed co-immunoprecipitation and GST pull down assays and established
physical interactions between FOXA2, LXRα and RXRα in vitro and in vivo. An
extended DNA binding domain (DBD) of LXRα is required for physical interactions
with the at least one of the two transactivation domains of FOXA2. In conclusion, the
findings of Part I and II suggest that the newly identified FOXA2 binding site in the
LPL promoter serves as a novel LXRE that facilitates the induction of the LPL gene
by oxysterols via FOXA2. Through an insulin-AKT-FOXA2-LPL signaling pathway the overexpression of LPL is prevented in the liver under conditions of cholesterol
overload protecting this tissue from the toxic effects of LPL.
In Part III we focused on the regulation of genes that are involved in HDL
biogenesis and the remodeling by transcription factor FOXA2 and LXRs in hepatic
cells. Previous studies had shown that mice heterozygous for FOXA2 have reduced
levels of HDL in the plasma. Using in silico analysis, we identified putative binding
sites for the FOXA2 factor in proximity with characterized LXR responsive elements
(LXREs) in the promoters of various human HDL genes encoding the lipid
transporters ABCG1, the hepatic lipase (LIPC) and the cholesteryl ester transfer
protein (CETP). In agreement with previous studies, we showed that treatment of
HepG2 cells and primary mouse hepatocytes with the synthetic LXR ligand,
T0901317, caused a strong induction of mRNA levels of ABCG1, ABCG5, ABCG8
and CETP genes. Inactivation of the FOXA2 factor by siRNA silencing or insulin in
primary mouse hepatocytes and HepG2 cells reduced the basal mRNA levels and also
the induction of ABCG5 and ABCG8 genes, by T0901317, indicating that FOXA2 is
critical for the upregulation of these lipid transporters by the LXR ligands. With
transactivation assays, we established that FOXA2 or LXRα/RXRα overexpression in
the presence of their ligands in HepG2 cells increased the activity of the promoters of
the ABCG5 and ABCG8 genes. In agreement with these findings, silencing the
expression of LXRα or LXRβ in HepG2 cells, via lentivirus expressing shRNAs
specific for each LXR isoform, reduced the mRNA levels of ABCG8 and ABCG5
genes. Furthermore, FOXA2 and ligand-activated LXRα/RXRα transactivated in a
synergistic manner the promoter of ABCG8 gene, but not the ABCG5 promoter.
Unexpectedly, FOXA2 inhibited the induction of the ABCG5 promoter by LXRs and
oxysterols in HepG2 cells, suggesting that more distal transcription factor binding
sites far from the coding regions of the genes may be involved and via DNA looping
regulate coordinately the expression of ABCG5 and ABCG8 genes. These findings
are in line with the synergistic transactivation of LPL promoter by nuclear receptors
LXRα/RXRα and the transcription factor FOXA2, as described above.
Understanding in depth the mechanisms by which lipid and glucose metabolic
pathways are interconnected in the liver by factors such as FOXA2 may open the way
to novel therapeutic strategies to increase HDL levels and protect patients with
metabolic diseases such as coronary heart disease, dyslipidemia, diabetes and the
metabolic syndrome.
(EN)
University of Crete
