Στις μέρες μας ένα μεγάλο ποσοστό ανθρώπων πάσχει από χρόνιες ασθένειες η θεραπεία των οποίων απαιτεί συνεχή χρήση φαρμάκων προκειμένου να ελαττωθεί η αίσθηση του πόνου. Αυτό όμως οδηγεί στην ανάπτυξη ανοχής του οργανισμού με αποτέλεσμα για την επίτευξη του ίδιου αναλγητικού αποτελέσματος να απαιτούνται υψηλότερες δόσεις φαρμάκου που με τη σειρά τους αυξάνουν τον κίνδυνο παρενεργειών και εθισμού. Τα αναλγητικά φάρμακα όπως η μορφίνη, η φαιντανύλη κ.α., ασκούν τις δράσεις τους καθώς προσδένονται στους μ απιοειδείς υποδοχείς (MOR), οι οποίοι συζεύγνονται με τις G πρωτεΐνες. Οι περισσότερες εξαρτησιογόνες ουσίες επιδρούν στο μεσολιμβικό σύστημα ανταμοιβής το οποίο εκτίνεται από VTA (Ventral Tegmental Area) ως τον επικλινή πυρήνα. Οι RGS (Regulators of G protein Signaling) πρωτεΐνες ρυθμίζουν την ένταση και τη δραστικότητα των G πρωτεϊνών μετά την ενεργοποίηση των μ υποδοχέων, δρώντας ως σημαντικοί ρυθμιστές στο σηματοδοτικό μονοπάτι του κυττάρου. Τρία μέλη της οικογένειας των RGS, RGS9-2, RGS4 και RGSz έχει δειχθεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στη δράση των αναλγητικών φαρμάκων. Η spinophilin είναι μια ευρέως εκφραζόμενη δενδριτική πρωτεΐνη που δρα ως σκαλωσιά για πληθώρα άλλων πρωτεϊνών. H spinophilin έχει σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στην μετάδοση της κυτταρικής σηματοδότησης αλλά και της πλαστικότητας των δενδριτικών ακάνθων. Ο ρόλος της spinophilin στην προσαρμοστική διεργασία που χαρακτηρίζει τον εθισμό στα οπιοειδή δεν έχει κατανοηθεί πλήρως. Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκε με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης οι αλληλεπιδράσεις τις spinophilin με συγκεκριμένες RGS πρωτεΐνες, RGS9-2, RGS4 και RGSz στην περιοχή του ραβδωτού και κατά πόσο η ένταση των συμπλόκων αλλάζει κατόπιν διέγερσης του υποδοχέα με διαφορετικούς αγωνιστές, μορφίνη ή φαιντανύλη. Και οι τρεις RSG πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με την spinophilin στη βασική κατάσταση. Η ανάλυση παροδικά επιμολυσμένων κυττάρων HEK293 με χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας αποκάλυψε ότι στη βασική κατάσταση η spinophilin συνεντοπίζεται με τον υποδοχέα MOR. Κατόπιν διέγερσης του MOR με μορφίνη ο υποδοχέας ενδοκυττώνεται σε διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα από αυτά που ενδοκυττώνεται η spinophilin. Η κυτταρική θέση της spinophilin παρατηρήθηκε και με πειράματα σε πραγματικό χρόνο (live imagine) που έγιναν σε ινοβλάστες διαμολυσμένους με ένα spinophilin-GFP όχημα. Τέλος, για τον έλεγχο του αν η spinophilin παίζει ρόλο στην σωστή τοποθέτηση RGS πρωτεϊνών στο κύτταρο πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοσοϊστοχημείας σε MEF κυτταρικές σειρές που είτε υπήρχε είτε απουσίαζε το γονίδιο της spinophilin. Παρατηρήσαμε ότι απουσία
spinophilin η RGS9-2 δε τοποθετείτε σωστά στην κυτταρική μεμβράνη. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται σε αυτήν την εργασία οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η spinophilin έχει ένα ουσιώδη ρόλο στην ρύθμιση της απόκρισης των υποδοχέων των μ οπιοειδών (MOR) στη δράση των RGS πρωτεϊνών και στις προσαρμοστικές αλλαγές που σχετίζονται με τον εθισμό σε οπιοειδή.
(EL)
The therapy of patients suffering from chronic diseases demands the repetitive use of drugs in order to alleviate the pain. However, that gradually leads to increasing drug tolerance necessitating larger drug doses to achieve the same effect. The later further increases the risk of side effects and addiction. Opioid analgetic drugs, such as morphine, fentanyl etc, exert their function by binding to μ opioid receptors (MOR) that belong to the GPCR receptor family. Such drugs act on mesoaccumbens dopamine system that projects from the Vental Tagmented Area (VTA) to the Nucleus Accumbens (NAc). RGS proteins regulate the activity and the effectiveness of μ opioid receptor after its activation, regulating the downstream signaling cascade in cells. Three RGS family members, RGS9-2, RGS4, and RGSz were previously shown to act as essential modulatory regulators of the opiate drug actions. Spinophilin, a dendritic protein is highly expressed in dendric spines and functions as a scaffolding protein for many other proteins as well. Spinophilin has a pivotal role in mediating signaling transduction and the orchestration of plasticity of dendric spines. However, the role of spinophilin in the adaptive process underlying opiate addiction is not fully understood. By using immunoprecipitation approach, the present study examined the interaction of spinophilin with specific RGS proteins, RGS9-2, RGS4, RGSz in NAc and how such interactions are altered following the administration of different drugs, i.e. fentanyl and morphine. Here, we show that all three RGS proteins interact with spinophilin under basal conditions. Moreover, confocal microscopic analysis in transiently transfected HEK293 cells revealed that spinophilin co-localize with MOR receptor. However, after treatment with morphine MOR receptor was internalized in cellular compartments distinct from those found of spinophilin. The cellular position of spinophilin was observed with live imagine experiments in MEF cells transfected with spinophilin::GFP vector. Finally, in order to examine if spinophilin plays a role in correct placement of RGS in plasma membrane, we performed immunochemistry experiments on WT and KO MEF cell lines for spinophilin protein. In the absence of spinophilin, RGS9-2 protein was not correctly placed at the plasma membrane. Together, these data suggest that spinophilin plays an essential role in MOR functional response as well as in the adaptive changes associated with opiate addiction.
(EN)
Πανεπιστήμιο Κρήτης
