Ο μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας β (TGFβ) είναι μια πλειοτροπική κυτταροκίνη η οποία ρυθμίζει πληθώρα βιολογικών διεργασιών όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η αιματοποίηση, η επούλωση πληγών και η απόπτωση. Ο TGFβ είναι μέλος μιας υπεροικογένειας κυτοκινών οι οποίες κωδικοποιούνται από 29 διαφορετικά γονίδια στον άνθρωπο. Η σηματοδότηση από αυτούς τους παράγοντες αρχίζει με πρόσδεση του TGFβ σε συγκεκριμένους διαμεμβρανικούς υποδοχείς με ενεργότητα σερίνης/θρεονίνης, τύπου Ι και τύπου ΙΙ. Ο ρόλος του TGFβ είναι να φέρει σε επαφή αυτές τις δύο κινάσες, σχηματίζοντας ένα ετερομερές σύμπλοκο υποδοχέων και να επιτρέψει την φωσφορυλίωση του τύπου Ι υποδοχέα από τον τύπου ΙΙ υποδοχέα. Στη συνέχεια, ο τύπου Ι υποδοχέας φωσφορυλιώνει τις Smad πρωτεΐνες, οι οποίες με τη σειρά τους σχηματίζουν ολιγομερή και μετατοπίζονται στον πυρήνα όπου ενεργοποιούν την μεταγραφή γονιδίων στόχων του TGFβ σε συνεργασία με πυρηνικούς παράγοντες και συνενεργοποιητές. Το κεντρικό Smad σηματοδοτικό μονοπάτι είναι ενσωματωμένο σε ένα σύμπλοκο θετικών και αρνητικών ρυθμιστών οι οποίοι επηρεάζουν σημαντικά την κυτταρική απόκριση στον TGFβ. Ο σκοπός του πρώτου μέρους της παρούσας διατριβής ήταν η εκπόνηση λειτουργικής χαρτογράφησης της περιοχής του συνδέτη της Smad3 πρωτεΐνης ο οποίος περικλείει μία μεταγραφικά ενεργή περιοχή, η οποία ταυτοποιήθηκε πρόσφατα στο εργαστήριο μας. Απότελέσματα από το εργαστήριο μας έδειξαν πρόσφατα ότι εσωτερική απαλοιφή της περιοχής 200-230 του συνδέτη καταστέλλει την μεταγραφική ικανότητα της Smad3 πρωτεΐνης. Σε πειράματα που περιγράφονται στην παρούσα διατριβή, επωάζοντας κύτταρα με κυκλοεξιμίδη, η οποία αναστέλλει την πρωτεινοσύνθεση, παρατηρήθηκε ότι η παραπάνω εσωτερική απαλοιφή δεν επηρεάζει την σταθερότητα της πρωτεΐνης. Πειράματα έμμεσου ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι η ίδια απαλοιφή δεν επηρεάζει την πυρηνική μετατόπιση της πρωτεΐνης. Τέλος, με πειράματα μεταγραφικής ενεργοποίησης δείχθηκε ότι αυτή η απαλοιφή κατέστειλε πλήρως την αλληλεπίδραση της Smad3 πρωτεΐνης με τον συνενεργοποιητή p/CAF. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, δημιουργήθηκε και εκπονήθηκε μια ενδελεχική λειτουργική χαρτογράφηση δύο σημειακών μεταλλάξεων της Smad3 πρωτεΐνης, Y237A και R287A, αμινοξέα τα οποία έρχονται σε άμεση επαφή με το αμινοξύ Ε239. Έχει καταγραφεί ότι μεταλλάξεις στο αμινοξύ Ε239 συναντιούνται συχνά σε καρκινοπαθείς. Επιπλέον, πειράματα στο εργαστήριο μας έδειξαν ότι η μεταγραφική δραστικότητα της μεταλλαγμένης Smad3 E239A καταστέλλεται πλήρως. Τα πειράματα αυτής της διατριβής έδειξαν ότι η σταθερότητα της Smad3 πρωτεΐνης επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από την μετάλλαξη Ε239Α, ενώ επηρεάζεται λιγότερο από τις μεταλλάξεις Υ237Α και R287A. Η σημειακή μετάλλαξη Υ237Α δεν επηρέασε την μεταγραφική δραστικότητα της Smad3 πρωτεΐνης, τον ομο- και ετεροπολυμερισμό της με την Smad4 πρωτεΐνη και την είσοδο της στον πυρήνα. Αντίθετα, η σημειακή μετάλλαξη R287A μείωσε δραματικά την μεταγραφική ενεργότητα της Smad3 πρωτεΐνης, κατέστειλε πλήρως την ικανότητα της να σχηματίζει ομοπολυμερή και ετεροπολυμερή με την Smad4 πρωτεΐνη και εμποδίζει την είσοδο της στον πυρήνα. Η ακεραιότητα του σηματοδοτικού μονοπατιού του TGFβ είναι απαραίτητη για την φυσιολογική ανάπτυξη και την ομοιόσταση των ιστών και η διαταραχή του από μεταλλάξεις αποτελεί την βάση για πολλά κληρονομήσιμα νοσήματα και για τον καρκίνο. Η χαρτογράφηση των περιοχών της Smad3 πρωτεΐνης που ευθύνονται για την μεταγραφική της δραστικότητα καθώς και συγκεκριμένα αμινοξέα τα οποία είναι σημαντικά για την λειτουργία της και την αλληλεπίδραση της με άλλες πρωτεΐνες, θα αποτελέσει χρήσιμη γνώση για την κατασκευή μορίων που θα επάγουν την TGFβ σηματοδότηση σε περιπτώσεις μεταλλάξεων των Smad πρωτεϊνών όπως ο καρκίνος του γαστρεντερολογικού συστήματος και του πνεύμονα, ή θα την καταστέλλουν σε περιπτώσεις υπερλειτουργίας του, όπως η ίνωση και οι μεταστάσεις.
(EL)
Transforming growth factor β (TGFβ) is a pleiotropic cytokine that regulates many biological processes including cellular proliferation, differentiation, haematopoiesis, wound repair and apoptosis. TGFβ is a member of a superfamily of cytokines encoded by 29 different genes in humans. Signal transduction by these factors is initiated by binding of TGFβ to specific transmembrane serine/threonine kinases called the type I and type II receptors. The role of TGFβ is to bring together these two kinases, forming a heteromeric receptor complex and allowing the phosphorylation of the type I receptor by the type II receptor. Then type I receptor phosphorylates Smad proteins, which in turn form oligomers and translocate to the nucleus where they activate the transcription of TGFβ target genes in cooperation with nuclear factors and coactivators. The core Smad signal-transduction pathway is embedded within a complex of positive and negative regulators that greatly influence the cellular response to TGFβ. The purpose of the first part of this Thesis was to perform a functional analysis of the linker domain of Smad3 that contains a novel transcriptionally active region identified recently in our lab. We had shown previously that an internal deletion of the 200-230 region of the linker severely inhibits the transactivation capacity of Smad3. By using the protein synthesis inhibitor cycloheximide, it was shown that the above internal deletion does not affect the stability of the protein. By performing indirect immunofluorescence, it was shown that the same deletion does not affect Smad3 nuclear translocation. Finally, using transactivation assays it was shown that this deletion abolished the functional interaction of Smad3 with the coactivator p/CAF. In the second part of the Thesis, it was constructed and performed a detailed functional analysis of two novel point mutants in Smad3 protein, Y237A and R287A, which are in direct contact with amino acid E239. It has been reported that mutations at amino acid E239 are found frequently in cancer patients. Furthermore, we have recently shown that the transcriptional activity of the Smad3 Ε239Α mutant is severely abolished. Τhe experiments of this Thesis showed that the stability of Smad3 protein is severely affected by the mutation E239A but affected to a lesser extent by mutations Y237A and R287A. The point mutation Y237A did not affect the transcriptional activity of Smad3, the homo- and hetero-oligomerisation with Smad4 and its nuclear import. On the contrary, the point mutation R287A drastically reduced transcriptional activity of Smad3, abolished its ability to form homo- and heteromers with Smad4 and prevented its nuclear import. The integrity of TGFβ signalling network is essential for normal development and tissue homeostasis, and its disruption by mutation underlies several inherited disorders and cancer. Elucidation of the transcriptionally active regions of Smad3 protein and the specific amino acids which are crucial for its activity and its interaction with other proteins could be important for constructing molecules that could either enhance TGFβ signalling (when Smad proteins are mutated in cancers of the lung or gastrointestinal cancers), or suppress TGFβ signalling (when its function is unregulated in fibrosis and metastasis).
(EN)
Πανεπιστήμιο Κρήτης
