ΣΚΟΠΟΣ: Τα τελευταία χρόνια, στελέχη του παράσιτου Leishmania υπεύθυνου για τη λεϊσμανίαση, έχουν αναπτύξει αντοχή σε φάρμακα πρώτης γραμμής για τη θεραπεία της νόσου, όπως στα άλατα αντιμονίου. Το παράσιτο διαθέτει το γονίδιο MDR το οποίο όταν ενεργοποιείται παράγει τη διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη Pgp 170 KDa που δρα σαν αντλία εκκροής, αδειάζοντας το φάρμακο από το σώμα του. Σκοπός της εργασίας ήταν η μελέτη του φαινόμενου της αντοχής στελεχών Leishmania, που έχουν απομονωθεί από ασθενείς και σκύλους από την Αττική, την Κρήτη και την Κύπρο, με τον εντοπισμό της P-γλυκοπρωτεΐνης 170 KDa με ποιοτικές και ποσοτικές δοκιμές σε στελέχη που είχαν χαρακτηριστεί ευαίσθητα και ανθεκτικά με την κυτταρομετρία ροής. Παράλληλα, μελετήθηκε και η in vitro ικανότητα μόλυν-σης της προμυελοκυτταρικής σειράς THP-1 από στελέχη Leishmania. Τα α-ποτελέσματα χαρτογραφήθηκαν με σκοπό την συσχέτιση διάφορων παραγόντων στην αντοχή και μολυσματικότητα των στελεχών.
ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Μετά από δοκιμές, in vitro σε 199 στελέχη με τη χρήση της κυτταρομετρίας ροής, επιλέγησαν 5 ανθεκτικά και 5 ευαίσθητα στελέχη βάσει του ρυθμού εκροής της φθορίζουσας Rhodamine 123 από το σώμα του παράσιτου μέσω της αντλίας Pgp 170 KDa. Η αντλία, γλυκοπρωτεΐνη Pgp 170 KDa, εντοπίστηκε στα 10 στελέχη στη μεμβράνη της αμαστιγωτής μορφής του παράσιτου μέσα σε ανθρώπινα μακροφάγα με τη χρήση σεσημασμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι της γλυκοπρωτεΐνης, και του συνεστιακού μικροσκοπίου. Συγκρίθηκε, ποιοτικά, η ένταση του σήματος φθορισμού της γλυκοπρωτεΐνης στα 10 στελέχη. Σε 2 στελέχη, ένα ανθεκτικό και ένα ευαίσθητο, μελετήθηκε ο αριθμός των αντιγράφων της γλυκοπρωτεΐνης μετά από σήμανσή τους με χρυσό, στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης. Οι δοκιμές επαναλήφθηκαν μετά την επώαση των στελεχών με αντιλεϊσμανιακό φάρμακο για να διαπιστωθεί αν, και πόσο, η επαφή του παράσιτου με φάρμακο ενεργοποιεί το γονίδιο MDR.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Διαπιστώθηκε ότι τα στελέχη που είχαν χαρακτηριστεί ως ευαίσθητα με την κυτταρομετρία ροής (χαμηλός ρυθμός εκροής της φθορίζουσας) παρουσίαζαν αδύναμο σήμα φθορισμού (της γλυκοπρωτεΐνης) στο συνεστιακό μικροσκόπιο και ελάχιστες ή καθόλου αντλίες (ανιχνεύθηκαν ελάχιστοι ή καθόλου κόκκοι χρυσού, και κατ' επέκταση αντλίες μετά από τη σήμανση τους με το μονοκλωνικό αντίσωμα C219) στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης σε σχέση με
τα ανθεκτικά στελέχη του παράσιτου στα οποία παρατηρήθηκε δυνατό σήμα φθορισμού και μεγαλύτερος αριθμός κόκκων χρυσού. Μετά από επαφή με το φάρμακο, ο αριθμός των αντλιών αυξήθηκε τόσο στα ανθεκτικά όσο και στα ευαίσθητα στελέχη.
Η χαρτογράφηση των αποτελεσμάτων της αντοχής και της μολυσματικής ικανότητας των 199 στελεχών για κάθε περιοχή μελέτης έδειξε ότι η Αττική και η Κρήτη ήταν οι περιοχές με την υψηλότερη μολυσματική ικανότητα των στελεχών και η παρουσία ανθεκτικών στελεχών στα φάρμακα χαρακτήρισαν τις περιοχές της Κύπρου και της Κρήτης ως υψηλού κινδύνου. Η πλειοψηφία των στελεχών που απομονώθηκαν ήταν του πιο κοινού ζυμοδέματος στη Μεσόγειο, του Leishmania infantum MON-1.
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Διαπιστώθηκε και μετρήθηκε ο ρόλος της Pgp 170 KDa
στην πολλαπλή αντοχή της Leishmania στα φάρμακα και η ενεργοποίηση της μετά από επαφή του παράσιτου στα φάρμακα, αλλά και η χρησιμότητα της κυτταρομετρίας ροής ως εργαλείο για το χαρακτηρισμό του βαθμού αντοχής στα φάρμακα του στελέχους που απομονώνεται από κάθε ασθενή για την πρόληψη αναζωπύρωσης της νόσου.
(EL)
Meglumine antimoniate is a first line drug for the treatment of visceral leish-maniasis. During the last years, isolates of Leishmania, the parasite responsi-ble for the disease, have developed resistance to this as well as other anti-leishmanial drugs because Leishmania possesses the MDR gene responsible for multidrug resistance. The aim of the project was the study of the pheno-menon of multidrug resistance in Leishmania with qualitative and quantitative tests using isolates from dogs and patients from Attica, Crete and Cyprus. The virulence of the isolates was also studied using human monocytes from a patient with acute monocytic leukemia (THP-1 cell line).
The resistance to drugs of 199 Leishmania isolates from Attica, Crete and Cyprus was studied by flow cytometry. Five resistant and five sensitive isolates were selected based on the rate of efflux of the fluorescent probe Rhodamine 123 from the parasite body. Human macrophages were infected with the 10 Leishmania isolates and the transmembrane efflux pump, the glycoprotein Pgp 170 KDa, was marked using the monoclonal antibody C219 after double immunofluorescence. Microscopic analysis by confocal micro-scopy revealed the P-glycoprotein 170 KDa on the membrane of the amasti-gote body and the intensity of the fluorescence signal was related to the re-sistance of each strain as it was revealed by flow cytometry. Transmission electron microscopy, using one resistant and one sensitive strain, after immu-nogold labeling of the Pgp 170 KDa, showed that the number of pumps re-lates to the resistance of the strain. This was further demonstrated when the strains were made resistant, after incubation in an antileishmanial drug, which induced the production of more pumps by the parasite.
The results of the study showed that the greater the rate of efflux of Rhoda-mine 123 in an isolate, during flow cytometry, the greater the fluorescence of the Pgp signal in the confocal microscope and the greater the number of Pgp efflux pumps in the transmission electron microscope (resistant strains). Thus, the results confirmed the important role of the Pgp efflux pump in the pheno-menon of multidrug resistance and the importance of flow cytometry as a tool
for the study of the resistance of Leishmania isolates for the prediction of the success of the treatment in humans and dogs.
The results of drug resistance for each isolate as well as its infectivity poten-tial were mapped for each study area and related to geographic and other fac-tors.
(EN)
Πανεπιστήμιο Κρήτης
