Η οξυγονική φωτοσύνθεση λαμβάνει χώρα στις μεμβράνες των θυλακοειδών των κυανοβακτηρίων, των πράσινων φυκών και των ανώτερων φυτών, όπου σύμπλοκα πρωτεϊνών/χρωστικών (φωτοσύστημα ΙΙ, κυτόχρωμα b6f, φωτοσύστημα Ι και ΑΤP συνθετάση) μετατρέπουν την ηλιακή ενέργεια σε χημική. Η πρωτεομική ανάλυση των φωτοσυνθετικών αυτών πρωτεϊνικών συμπλόκων σε λειτουργική μορφή αποτελεί μία πειραματική προσέγγιση η οποία επιτρέπει τόσο δομική ταυτοποίηση όσο και λειτουργική ιχνηλάτηση σχετικά με την πλαστικότητα της μοριακής δομής και λειτουργίας του φωτοσυνθετικού μηχανισμού. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η λειτουργική ανάλυση καθώς και ο δομικός χαρακτηρισμός του φωτοσυνθετικού πρωτεόματoς του μονοκύτταρου χλωροφύκους Scenedesmus obliquus. Αρχικά, τα χλωροφυλλικά πρωτεϊνικά σύμπλοκα μεμβρανών από τα πράσινα άλγη Scenedesmus obliquus, απομονώθηκαν οι θυλακοειδείς μεμβράνες μετά από διαλυτοποίηση με το μη ιοντικό απορρυπαντικό dodecyl-β-maltoside και χαρακτηρίστηκαν με τη χρήση της φασματοσκοπίας ορατού, SDS-Tricine PAGE, BN-PAGE και CN-PAGE. Οι δύο τελευταίες τεχνικές ηλεκτροφόρησης συγκρίθηκαν μεταξύ τους, σχετικά με τη διαχωριστική ικανότητα τους. Στη συνέχεια, μετά από διαλυτοποίηση των θυλακοειδών μεμβρανών ακολούθησε κλασματοποίηση με διαβάθμιση ζάχαρης. Τα κλάσματα των χλωροφυλλικών πρωτεϊνών χαρακτηρίστηκαν από τη φασματοσκοπία ορατού, SDS-Tricine PAGE, BN-PAGE και τη δυναμική σκέδαση φωτός (DLS). Η μέθοδος BN-PAGEεμφάνισε την παρουσία επτά πρωτεϊνικών συμπλόκων με τα μοριακά βάρη στη σειρά 68, 118, 157, 320, 494, 828 και 955 kDa, αντίστοιχα. Περαιτέρω, η σκέδαση φωτός, αποκαλύπτει την ταυτόχρονη παρουσία μορίων διαφορετικών μεγεθών στα 3-4 nm και 6.0-7.5 nm σειράς, αντίστοιχα. Το μικρότερο μέγεθος συσχετίζεται με την υδροδυναμική ακτίνα της τριμερούς μορφής του LHCII, εκτιμώντας ότι το μεγαλύτερο μέγεθος συνδέεται με την παρουσία των κέντρων αντίδρασης του φωτοσυστήματος Ι και φωτοσυστήματος ΙΙ. Επιπλέον, οι λειτουργικές πληροφορίες σχετικά με τις πρωτεΐνες μελετήθηκαν με τη χρήση της φασματοσκοπίας μάζας (MALDI-TOF MS) από μιας λεπτομερούς χαρτογράφησης 2-D_SDS-Tricine PAGE /BN-PAGE, διαλυτοποιημένων θυλακοειδών μεμβρανών του οργανισμού Scenedesmus obliquus.
(EL)
The oxygenic photosynthesis takes place in the thylacoid membranes of cyanobacteria, green algae and higher plants, where protein/pigments complexes (photosystem II, cytochrome b6f, photosystem I, and ATP synthase) convert the light energy into chemical energy. The proteomic analysis of photosynthetic protein complexes constitutes an experimental approach which allows not only structural identification but also functional tracer with regard to the plasticity of molecular structure and function of photosynthetic apparatus. The aim of the present study is the functional analysis as well as the structural characterization of the unicellular green alga Scenedesmus obliquus photosynthetic proteome. Firstly, the chlorophyll (Chl)-containing membrane protein complexes from the green alga Scenedesmus obliquus have been isolated from the thylakoid membranes by solubilization with the non-ionic detergent dodecyl-β-maltoside and characterized by absorptions spectroscopy, tricine SDS PAGE, BN-PAGE and CN-PAGE. The last two electrophoresis techniques compared each other, relatively to their separative capacity. Secondly, after the solubilization of thylakoid membranes followed fractionation by a sucrose density gradient. The Chl-containing protein fractions were characterized by absorptions spectroscopy, tricine SDS PAGE, BN-PAGE, and dynamic light scattering (DLS). BN-PAGE showed the presence of seven protein complexes with molecular weights in the range of 68, 118, 157, 320, 494, 828 and 955 kDa, respectively. Further, light scattering reveals the simultaneous presence of particles of different sizes in the 3-4 nm and 6.0-7.5 nm range, respectively. The smaller size is related to the hydrodynamic radius of the trimer Light Harvesting Complex (LHCII), whereas the larger size is associated with the presence of photosystem I and photosystem II reaction centers. Additionally, functional information regarding protein-protein interactions was assembled, by coupling 2-D BN-PAGE with MALDI-TOF MS and a detailed mapping of Scenedesmus obliquus photosynthetic proteome of the solubilized thylakoid membranes was presented.
(EN)
Πανεπιστήμιο Κρήτης
