Ο Mac1 αποτελεί χαλκορυθμιζόμενο μεταγραφικό παράγοντα του Saccharomyces cerevisiae. Ως ρόλο έχει τη ρύθμιση γονιδίων (CTR1, CTR3, FRE1, FRE7), οι πρωτεΐνες των οποίων είναι υπεύθυνες για την είσοδο του χαλκού στο κύτταρο. Η Μac1 περιλαμβάνει περιοχή υπεύθυνη για την πρόσδεση της στο DNA καθώς και περιοχή ρύθμισης της μεταγραφής εξαρτώμενη από την διαθεσιμότητα του χαλκού στο κύτταρο. Προηγούμενα στοιχεία έδειξαν ότι εκτός του χαλκού και πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις μπορούν να τροποποιήσουν την λειτουργικότητα του Μac1(Voutsina et al, 2000). Για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν και ρυθμίζουν την ενεργότητας του Mac1 έγιναν πειράματα σάρωσης γενωμικής βιβλιοθήκης με την τεχνολογία των δύο υβριδίων (Α. Βουτσινά, αδημοσίευτα αποτελέσματα). Μεταξύ των αλληλεπιδρώντων βρέθηκε και η πυρηνική φωσφοπρωτεΐνη Rad9. Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη ανήκει στην κατηγορία των γονιδίων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και παίζει σημαντικό ρόλο στην μεταβίβαση σήματος για επιδιόρθωση DNA όταν αυτό υποστεί βλάβη από ακτινοβόληση. Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας είναι να επιβεβαιωθεί η αλληλεπίδραση της Rad9 με τον Mac1 και επίσης να διερευνηθούν οι φυσιολογικές συνθήκες στις οποίες συμβαίνει αυτό. Προκειμένου να επιτευχθεί αυτό ακολουθήθηκαν οι πιο κάτω προσεγγίσεις. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα in vivo συνανοσοκατακρύμνισης των δυο πρωτεϊνών τα οποία επιβεβαίωσαν την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών, σε εκχυλίσματα καλλιεργειών που αναπτύχθηκαν σε συνθήκες SC ή έλλειψης χαλκού και παράλληλα κατασκευάστηκαν κατάλληλα εργαλεία (πλασμιδιακές κατασκευές) για ετερόλογη έκφραση σε βακτήρια και για περαιτέρω διερεύνηση της in vitro αλληλεπίδρασης των δυο πρωτεϊνών και υποπεριοχών τους. Επίσης πραγματοποιήθηκαν πειράματα μέτρησης της έκφρασης του CTR1 γονιδίου απουσία του γονίδιου RAD9 σε συνθήκες περίσσειας και απουσίας χαλκού όπου και φάνηκε ότι η έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου επάγεται σε συνθήκες SC προσδίδοντας στην Rad9 ρόλο άμεσου ή έμμεσου καταστολέα. Τέλος σε πειράματα μέτρησης της μεταγραφικής ενεργότητας του LexAMac1, φάνηκε οτι ενεργοποιείται λιγότερο σε rad9Δ στελέχη συγκριτικά με στελέχη άγριου τύπου, σε συνθήκες χαμηλής συγκέντρωσης χαλκού. Τα αποτελέσματα αυτά αν και φαινομενικά αντικρουόμενα κάνουν ενδιαφέρουσα την περαιτέρω διερεύνηση της φυσιολογικής σημασίας της αλληλεπίδρασης αυτής αλλά και των συνθηκών στις οποίες συμβαίνει.
(EL)
In Saccharomyces cerevisiae, Mac1 is a copper-regulated DNA binding transcription factor that, under copper depletion conditions, activates genes involved in copper uptake (CTR1, CTR3, FRE1, FRE7). Previous evidence suggested that, in addition to copper, protein interactions could modulate Mac1 function (Voutsina et al, 2000). In order to identify such proteins, a genomic expression library was screened using the two hybrid technology (A. Voutsina unpublished data). Among the potentially Mac1-interacting proteins, Rad9 was identified, a nuclear phosphoprotein, a prototype DNA-damage checkpoint protein required for the DNA checkpoint pathway through out the cell cycle. In this study there has been an effort to confirm the interaction between Rad9 and Mac1, to examine the physiological conditions under which the interaction takes place, and to initiate an analysis of the possible biological role of this interaction. In vivo coimmunoprecipitation assays of Rad9 and Mac1 showed that the two proteins interact in extracts that were taken from cells grown either in media depleted from copper or containing low copper. Besides that, domains of Rad9 were subcloned in appropriate expression vectors to identify in vitro the specific region of Rad9 that interacts with Mac1. Moreover, the accumulation of CTR1 mRNA in compared to wild type cultures grown under high copper, low copper or copper starvation was measured. We found CTR1 transcription induced in rad9Δ cells in the presence of high or low copper. Therefore, Rad9 may act directly or indirectly as a repressor of CTR1 transcription. We also measured the transcriptional activity of LexAMac1, tethered to LexAbinding DNA sites, in rad9Δ compared to wild type cells to see if the transactivation function of Mac1 was affected. We observed that Mac1 transcriptional activity was reduced in cells grown in low copper. These initial results, although not easily explained, are quite challenging to further investigate the physiological role of Mac1-Rad9 interaction.
(EN)
