Οι μεταλλάξεις του MEFV γονιδίου σχετίζονται με τον Οικογενή Μεσογειακό Πυρετό (Familial Mediterranean Fever/ FMF), μια αυτοφλεγμονώδη ασθένεια της οποίας η παθογένεια βασίζεται στην μη ελεγχόμενη ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων. Αυτό οδηγεί σε ενεργοποίηση αυτοφαγικών μονοπατιών και εξωκυττάρωση παγίδων χρωματίνης από τα ουδετερόφιλα (Neutrophil Extracellular Traps/NETs) οι οποίες φέρουν προφλεγμονώδη ιντερλευκίνη 1β (IL-1β) και τελικά δημιουργείται ένας φαύλος κύκλος φλεγμονής. Τέτοιες μεταλλάξεις πρόσφατα βρέθηκαν σε υψηλή συχνότητα σε ασθενείς με Χρόνια Ιδιοπαθή Ουδετεροπενία (Chronic Idiopathic Neutropenia /CIN). Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την συσχέτιση των MEFV μεταλλάξεων στους ασθενείς με CIN, με την ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων τους και την αυξημένη παραγωγή NETs, όπως συμβαίνει στον FMF. Η πειραματική διαδικασία που ακολουθήσαμε ήταν να συγκαλλιεργήσουμε υγιή ουδετερόφιλα με ορούς ασθενών και είτε να χρησιμοποιήσουμε τα υπερκείμενα των καλλιεργειών για να ποσοτικοποιήσουμε τα NETs με sytox green χρώση για το εξωκυττάριο DNA και DNA/MPO ELISA είτε να χρησιμοποιήσουμε τα κύτταρα για ανοσοιστοχημεία και συνεστιακή μικροσκοπία. Επιπλέον, για να ερευνήσουμε την αυθόρμητη παραγωγή NETs απομονώσαμε ουδετερόφιλα απευθείας από ασθενείς. Μετά από σύγκριση CIN ασθενών με μεταλλάξεις, CIN ασθενών αρνητικών για μεταλλάξεις και υγειών ατόμων καταλήξαμε ότι η παραγωγή NETs δεν αυξάνεται σημαντικά σε ασθενείς με μεταλλάξεις. Οι καλλιέργειες των κυττάρων των ασθενών ex vivo, μας έδωσε μια ένδειξη ότι στα κύτταρα των CIN ασθενών επάγεται μεγαλύτερη παραγωγή NETs, ανεξάρτητα από τις μεταλλάξεις στο γονίδιο MEFV. Βασιζόμενοι στον μοριακό μηχανισμό του FMF, εκτός από την παραγωγή NETs, τα ουδετερόφιλα των ασθενών αυτών θα πρέπει να διερευνηθούν για την αυτοφαγία και την παραγωγή κυτταροκινών. Αφού μελετηθούν και αυτοί οι παράγοντες, θα μπορέσουμε να καταλήξουμε σε ένα συμπέρασμα για το επίπεδο ενεργοποίησης των ουδετερόφιλων στους προς μελέτη ασθενείς, το κατά πόσο οι μεταλλάξεις επηρεάζουν τον κυτταρικό φαινότυπο και εάν οι μηχανισμοί της ουδετεροπενίας αλληλεπιδρούν/εξουδετερώνουν τους μηχανισμούς του Μεσογειακού Πυρετού. Αυτές οι απαντήσεις όχι μόνο θα οδηγήσουν σε πιο προηγμένη κατηγοριοποίηση και παρακολούθηση των ασθενών με ουδετεροπενία, αλλά και σε διαλεύκανση του παθογενετικού μηχανισμού της Χρόνιας Ιδιοπαθούς Ουδετεροπενίας, ένα πεδίο προς μελέτη.
(EL)
MEFV gene mutations are associated with Familial Mediterranean Fever (FMF), an autoinflammatory disease whose pathogenesis is based on neutrophils’ activation with entry in autophagy and extrusion of Neutrophil Extracellular Traps (NETs) decorated with the cytokine IL-1b, creating a vicious cycle of excessive inflammation. Such mutations were recently found in increased frequency in a cohort of patients with Chronic Idiopathic Neutropenia (CIN). Here, we investigated an association between MEFV mutations in CIN patients and neutrophils’ activation evident with increased NETosis, as in the case of FMF. The experimental procedure we followed was to co-culture healthy PMNs with serum from patients and either use the supernatants of the cultures to quantify NETs with sytox green staining for extracellular DNA and dsDNA/MPO complexes ELISA or to use the treated cells for NETs immunostaining using confocal microscopy. In addition, PMNs directly isolated from patients were used to detect their direct response as regards to spontaneous NETosis induction. After comparison of CIN patients with likely pathogenic MEFV mutations, CIN patients negative for MEFV mutations and healthy individuals we concluded that NETosis isn’t significantly increased in patients with MEFV mutations. Ex vivo culture of patients PMNs and microscopic observation gave us an indication that CIN patients, regardless of their MEFV variations, present an increase in NETosis as compared to healthy individuals. However, NETosis is only one process that indicates neutrophils’ activation. So, based on FMF’s molecular mechanism, neutrophils should also be studied for autophagy and production of inflammatory cytokines. Then, their activation status will be clear and we could conclude whether MEFV mutations affect CIN patients’ phenotype and if not, whether there is a counterbalancing effect of CIN and FMF’ mechanisms co-existence. This information will not only characterize the particular cohort of patients and potentially change the categorization criteria and follow up approaches, but will also shed light to CIN’s pathogenesis mechanism which is not clearly defined yet.
(EN)
