Εισαγωγή: Η TDP-43 (TAR DNA-binding protein-43) πρωτεΐνη έχει πλέον αναγνωριστεί ως o
μοριακός κρίκος, ο οποίος συνδέει πολλές από τις μέχρι πρόσφατα θεωρούμενες
ξεχωριστές οντότητες νοσημάτων, που σήμερα συγκροτούν το φάσμα μετωποκροταφικής
άνοιας / πλάγιας μυατροφικής σκλήρυνσης FTD/ALS. Η TDP-43 είναι το κύριο συστατικό των
ουβικουιτινωμένων εγκλείστων που ανευρίσκονται τόσο στην FTD όσο και στην ALS. Η
αιτιώδης συνάφεια της νευροεκφυλιστικής διεργασίας με την TDP-43 πρωτεΐνη, προήλθε
από την αναγνώριση παθογόνων μεταλλάξεων στο γονίδιο TARDBP, που την κωδικοποιεί,
σε οικογένειες του φάσματος FTD/ALS. Εντούτοις, TDP-43 πρωτεϊνοπάθεια έχει
παρατηρηθεί και σε φορείς μεταλλάξεων και άλλων γονιδίων που σχετίζονται τόσο με την
FTD όσο και με την ALS, αλλά και με άλλες νόσους, όπως μια μορφή της νόσου Alzheimer
(AD), καταδεικνύοντας έτσι έναν γενικότερο καθοριστικό ρόλο της TDP-43 στην
νευροεκφυλιστική διεργασία.
Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση της TDP-43 πρωτεϊνοπάθειας και
ειδικότερα:
1. Η μέτρηση των επιπέδων της TDP-43 πρωτεΐνης στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ)
ως υποψήφιος διαγνωστικός βιοδείκτης για το φάσμα FTD/ALS.
2. Η ανίχνευση γενετικών αλλαγών στο γονίδιο TARDBP, αλλά και σε άλλα γονίδια
σχετιζόμενα ή όχι με TDP-43 πρωτεϊνοπάθεια (C9οrf72, GRN, VCP κτλ.) και η
αξιολόγηση της συνεισφοράς των γενετικών αλλαγών αυτών στον κλινικό
φαινότυπο.
3. Η πιθανή συσχέτιση των γενετικών αλλαγών με τα επίπεδα της TDP-43 στο ΕΝΥ,
αλλά και με τα επίπεδα των “κλασσικών” βιοδεικτών για την AD, δηλαδή την ολική
πρωτεΐνη (τΤ), την φωσφορυλιωμένη μορφή αυτής (τΡ-181) και το β-αμυλοειδές
πεπτίδιο με 42 αμινοξέα (Αβ42).
Ασθενείς και Μέθοδοι: Ο πληθυσμός της μελέτης αποτελείται από 54 ασθενείς με FTD, 61
ασθενείς με ALS και 14 ασθενείς με FTD-ALS, οι οποίοι διαγνώστηκαν με τα πλέον
πρόσφατα διαγνωστικά κριτήρια, υποστηριζόμενα από τους “κλασσικούς” βιολογικoύς δείκτες για την AD προκειμένου, ειδικά για την ομάδα FTD, να αποκλεισθεί η παρείσφρηση
της μετωπιαίας και λογοπενικής παραλλαγής της AD. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των
επίπεδων της TDP-43 και των κλασικών βιοδεικτών στο ΕΝΥ έγινε με μεθόδους ενζυμικής
ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας διπλού σάντουιτς [double-sandwich enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA).
Στους ασθενείς πραγματοποιήθηκε επίσης έλεγχος για τον εντοπισμό παθολογικών
εξανουκλεοτιδικών επαναλήψεων (GGGGCC)n του γονιδίου C9orf72, με την μέθοδο
αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και PCR με τη χρήση εκκινητών
επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας (repeat-primed PCR), σε συνδυασμό με
αυτοματοποιημένη ανάλυση τμημάτων DNA. Στους ασθενείς με απουσία παθολογικού
αριθμού εξανουκλεοτιδικών επαναλήψεων πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση ολόκληρου
του εξώματος (whole exome sequencing).
Τα επίπεδα των βιοδεικτών συγκρίθηκαν με ομάδα ελέγχου 28 υγιών ατόμων, χωρίς
νοητική ή κινητική διαταραχή και οι γενετικές αλλαγές με ένα ήδη πολύ καλά
χαρακτηρισμένο δείγμα 81 νοητικά υγιών μαρτύρων από την Κρήτη. Επίσης, αναζητήθηκαν
αλλαγές σε FTD/ALS γονίδια σε ένα πληθυσμό 100 με AD ασθενών με άνοια (AD τύπου) από
την Κρήτη (Μελέτη Γήρανσης της Κρήτης).
Αποτελέσματα: Στατιστικά σημαντικά υψηλότερες τιμές TDP-43 στο ΕΝΥ ανευρέθηκαν σε
όλες τις ομάδες ασθενών (FTD, ALS, FTD-ALS), σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Τα επίπεδα
TDP-43 των ασθενών με ALS ήταν αυξημένα σε σχέση με αυτά των ασθενών με FTD, ωστόσο
αυτή η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Στατιστικά σημαντικά υψηλότερα επίπεδα
τT ανευρέθηκαν σε όλες τις ομάδες ασθενών, σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες, με τα
επίπεδα των ασθενών με FTD να είναι αυξημένα σε σχέση με αυτά των ασθενών με ALS. Τα
επίπεδα της τP-181 και του Αβ42 δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ των ομάδων ασθενών. Η
ανάλυση ROC έδειξε ότι ο συνδυασμός των επίπεδων της TDP-43 στο ΕΝΥ με τις πρωτεΐνες
T(tau), εκφραζόμενος με τον τύπο TDP-43×τT/τP-181 έχει υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα
(>80%), για τον διαχωρισμό ασθενών του φάσματος ALS/FTD από υγιείς μάρτυρες.
Με την γενετική ανάλυση εντοπίστηκαν παθογόνες και πιθανά παθογόνες αλλαγές στο
18,6% (24/129) των ασθενών του φάσματος ALS/FTD. Τα γονίδια που εμφανίζονταν αυτές οι αλλαγές ήταν με φθίνουσα σειρά συχνότητας, τα γονίδια C9orf72, TARDBP, GRN, VCP,
SOD1 και FUS. Η μέση ηλικία έναρξης της νόσου των ασθενών με παθολογική επέκταση
εξανουκλεοτιδίου στο C9orf72 ήταν κατά 10 περίπου έτη μικρότερη σε σχέση με τους
υπόλοιπους ασθενείς. Η p.Ile383Val TARDBP αλλαγή βρέθηκε και σε 2 ασθενείς
διαγνωσμένους με άνοια στην Κρήτη.
Εξετάζοντας τα επίπεδα της TDP-43, Aβ42, τΤ και τp-181 διαπιστώσαμε ότι οι φέροντες
μετάλλαξη (επέκταση εξανουκλεοτιδίου) του C9orf72 γονιδίου ασθενείς με ALS (με ή χωρίς
FTD), όπως και οι φορείς της συνώνυμης αλλαγής p.Asp285Asp στο γονίδιο MAPT,
παρουσίαζαν στατιστικώς σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα τΡ-181 σε σχέση με τους
υπολοίπους ασθενείς. Επίσης, οι φορείς σπάνιων αλλαγών του APP είχαν χαμηλότερα
επίπεδα Αβ42, σε σχέση με τους ασθενείς που δεν έφερες αντίστοιχες αλλαγές.
Συμπεράσματα: Η TDP-43 πρωτεϊνοπάθεια είναι νόσος με σημαντική κλινική και γενετική
ετερογένεια. Εκφράζεται κυρίως στο προγεροντικό φάσμα ηλικιών και στον Ελληνικό
πληθυσμό, εντούτοις γεροντική εμφάνιση αναγνωρίζεται ολοένα και περισσότερο. Τα
υψηλά επίπεδα της TDP-43 στο ΕΝΥ σε συνδυασμό με τις πρωτεΐνες T (tau) με τον τύπο
TDP-43×τT/τP-181 έχουν υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα και ως εκ τούτου αποτελούν έναν
εν δυνάμει βιοδείκτη της TDP-43 πρωτεϊνοπάθειας. Το πιο συχνό γονίδιο που συνδέεται με
TDP-43 πρωτεϊνοπάθεια στον Ελληνικό πληθυσμό είναι το C9orf72, με υψηλή συχνότητα
10,8% (14/129) σε σχέση με άλλους Ευρωπαϊκούς πληθυσμούς και το οποίο φέρει την
ηλικία έναρξης της νόσου 10 χρόνια νωρίτερα σε σχέση με τις σποραδικές μορφές. Η
αλλαγή p.Ile383Val στο γονίδιο της TARDBP ίσως είναι πιο συχνή στον Ελληνικό πληθυσμό
σε σχέση με άλλους πληθυσμούς και σε ασθενείς του γεροντικού φάσματος ηλικιών και
χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.
(EL)
Introduction: TDP-43 (TAR DNA-binding protein-43), encoded by the TARDBP gene, has
recently been identified as the molecular link, which connects the, until recently considered,
separate entities that currently form the FTD/ALS spectrum. Specifically, TDP-43 is the main
component of ubiquitinated inclusions found in both FTD and ALS. The direct causal
relationship of TDP-43 with the neurodegenerative process was suggested by the discovery
of pathogenic variants in the TARDBP gene, in families with members presenting with
FTD/ALS. Furthermore, TDP-43 proteinopathy has been observed in carriers of pathogenic
variants in additional genes associated with both FTD and ALS, as well as in patients with an
Alzheimer’s disease (AD) subtype, thus demonstrating a more general role of TDP-43 in the
neurodegenerative process.
The purpose of this dissertation is to investigate TDP-43 proteinopathy in Greek patients with
neurodegenerative diseases and in particular:
1. To measure TDP-43 protein levels in the cerebrospinal fluid (CSF) as a candidate
diagnostic biomarker for the FTD/ALS spectrum.
2. To detect genetic changes in the TARDBP gene, as well as in other genes associated
with FTD/ALS and to evaluate their contribution to the clinical phenotype.
3. To correlate genetic changes not only with the TDP-43 levels in the CSF, but also with
the levels of "classical" biomarkers for Alzheimer's disease (AD), i.e. total tau protein
(τΤ), its phosphorylated form (τΡ-181) and the β-amyloid peptide with 42 amino acids
(Αβ42).
Patients and Methods: The study population consisted of 54 patients with FTD, 61 patients
with ALS and 14 patients with FTD-ALS, who were diagnosed with the most recent diagnostic
criteria, supported by the “classical” AD biomarkers (τΤ, τΡ-181 and Αβ42), in the CSF, to rule out
the inclusion of patients with frontal and logopenic variant of AD in the FTD subgroup. The
quantitative determination of TDP-43 levels and “classical” biomarkers in the CSF was
performed by double-sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Patients were screened for pathogenic hexanucleotide repeat expansion (GGGGCC)n in the
C9orf72 gene, using the repeat-primed polymerase chain reaction (PCR) method, while
C9orf72 (-) patients underwent whole exome sequencing.
The levels of biomarkers were compared with a control group of 28 healthy individuals
without mental or motor impairment and the genetic changes with an already very wellcharacterized
sample of 81 healthy aged adults from Crete. Also, 100 patients from Crete
diagnosed with dementia (of the AD type) were tested for pathogenic variants in FTD/ALS
genes.
Results: Statistically significant higher TDP-43 levels in the CSF were found in all patient
groups (FTD, ALS, FTD/ALS), compared to healthy controls. Patients with ALS showed a
tendency to have higher CSF TDP-43 levels compared to patients with FTD. Significantly higher
levels of τΤ were found in all groups, compared to healthy controls, with the FTD group
showing increased levels compared to the ALS group. The levels of τΡ-181 and Aβ42 did not
differ significantly among patient groups. ROC analysis showed that the combination of TDP-
43 with τ proteins, as expressed by the formula TDP-43 × τΤ/τΡ-181 has high sensitivity and
specificity (> 80%), for separation of ALS/FTD spectrum patients from healthy controls.
Genetic analysis revealed pathogenic or likely pathogenic variants in 18.6% (24/129) of
patients in the ALS/FTD spectrum. Genes harboring these variants included, in a decreasing
order of frequency, the C9orf72, TARDBP, GRN, VCP, SOD1 and FUS genes. The average age
of disease onset in patients with the C9orf72 repeat expansion was about 10 years earlier
compared to other patients. In 2 patients from Crete initially diagnosed as AD we identified
the p.Ile383Val variant.
Patients with ALS, either alone or concurrently with FTD, harboring the C9orf72 repeat
expansion and the MAPT p.Asp285As change had significantly lower levels of τΡ-181 compared
to the other patients. Also, carriers of rare APP variants had lower levels of Aβ42, compared
to non-carriers.
Conclusions: TDP-43 proteinopathy is a disease entity with significant clinical, biochemical
and genetic heterogeneity. It has been traditionally thought to be present in younger patients
compared to other neurodegenerative disorders; however, recently it is increasingly recognized among the elderly. The combination of TDP-43 with tau proteins in the CSF, as
expressed by the formula TDP-43×τT /τP-181, has high sensitivity and specificity and is therefore
a potential biomarker of TDP-43 proteinopathy. The most common gene variant associated
with TDP-43 proteinopathy in the Greek population is the C9orf72 repeat expansion with a
high frequency of 10,8% (14/129) compared to other European populations and is associated
with the disease onset 10 years earlier than the sporadic forms. The variant p.Ile383Val in the
TARDBP gene is another common pathogenic variant in the Greek population.
(EN)
