Η υποοικογένεια Β των υποδοχέων που συζεύγνυνται με τις G-πρωτεΐνες (GPCRs) περιλαμβάνει υποδοχείς που δεσμεύουν πεπτίδια όπως η σεκρετίνη, το εντερικό αγγειοδραστικό πεπτίδιο, το γλυκαγόνο, τον εκλυτικό παράγοντα της κορτικοτροπίνης (CRF), τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στη λειτουργία του οργανισμού. Οι υποδοχείς αυτοί, όπως όλοι οι υποδοχείς GPCRs, είναι πρωτείνες της πλασματικής μεβράνης των κυττάρων και έχουν κοινή δομή, η οποία περιλαμβάνει επτά διαμεμβρανικές περιοχές (TMs), οι οποίες έχει δειχθεί ότι δεσμεύουν μικρά μόρια όπως η ανταλαρμίνη, ένας μη πεπτιδικός ανταγωνιστής του τύπου 1 υποδοχέα του CRF (CRF1). Αυτό οδηγεί στην υπόθεση ότι παρόμοια με την υποοικογένεια Α των GPCRs, στην οποία ανήκουν οι υποδοχείς της ροδοψίνης, οι διαμεμβρανικές περιοχές της υποοικογένειας Β των GPCRs σχηματίζουν μια κοιλότητα, την κοιλότητα θέσεων δέσμευσης, που εκτείνεται από την εξωκυττάρια επιφάνεια του υποδοχέα, μέχρι το τμήμα που βρίσκεται μέσα στη φωσφολιπιδική διπλοστιβάδα της πλασματικής μεμβράνης του κυττάρου. Η επιφάνεια της κοιλότητας αυτής σχηματίζεται από αμινοξέα που αλληλεπιδρούν με μικρά μόρια, καθώς και από άλλα που παίζουν δομικό ρόλο, επηρεάζοντας τη δέσμευση έμμεσα. Ωστόσο η έλλειψη πληροφοριών για τη δομή των υποδοχέων της υποοικογένειας Β των GPCRs καθιστά αδύνατη την επιβεβαίωση της υπόθεσης αυτής.
Για να ελέγξουμε την παραπάνω υπόθεση, αρχίσαμε να λαμβάνουμε πληροφορίες για τη δομή των υποδοχέων της υποοικογένειας Β των GPCRs, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο τον CRF1 υποδοχέα και εξετάσαμε την αντίδρασή του με το φορτισμένο, υδρόφιλο, λιπόφοβο, μεθανοθειοσουλφονικό (MTS) αντιδραστήριο μεθανοθιοθειϊκό-αιθυλ-αμμώνιο (MTSEA). Η αντίδραση του MTSEA με τον CRF1 βασίστηκε στην ικανότητά του να αναστέλλει μη αντιστρεπτά τη δέσμευση της [125 l]--σοβαγίνης στον υποδοχέα. Η αντίδραση του MTSEA με τον CRF1 μείωσε τη δέσμευση της [125 l] -σοβαγίνης στον CRF1. Τα αποτελέσματα αυτά, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι ο ανταγωνιστής ανταλαρμίνη προστάτεψε την προκαλούμενη από το MTSEA μείωση της δέσμευσης, οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το αντιδραστήριο αυτό αντέδρασε με τη σουλφυδρυλική ομάδα μιας ή περισσότερων από τις ενδογενείς κυστείνες του CRF1. Για να εξακριβώσουμε την υπεύθυνη κυστείνη (-ες), μεταλλάξαμε σε σερίνες, μια την κάθε φορά, τις τέσσερις ενδογενείς κυστείνες, Cys128, Cys211, Cys233 και Cys364, που βρίσκονται στην πρώτη (TM1), τρίτη (ΤΜ3), τέταρτη (ΤΜ4) και έβδομη (ΤΜ7) διαμεμβρανική περιοχή του CRF1. Σε αντίθεση με τη μετάλλαξη της Cys128, η μετάλλαξη των Cys211, Cys233 και Cys364 σε σερίνη, μείωσε σημαντικά την ευαισθησία του υποδοχέα στο MTSEA. Τα αποτελέσματα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα ότι οι Cys211, Cys233 και Cys364 του CRF1, είναι προσανατολισμένες προς την κοιλότητα θέσεων δέσμευσης του υποδοχέα και η αντίδρασή τους με το MTSEA μείωσε τη δέσμευση της σοβαγίνης.
Στη συνέχεια μεταλλάξαμε ένα την κάθε φορά, 18 αμινοξέα της τρίτης διαμεμβρανικής περιοχής (ΤΜ3) του CRF1 σε κυστείνη (τεχνητές κυστείνες) και προσδιορίσαμε τη διαθεσιμότητα των τεχνητών κυστεϊνών, να αντιδράσουν με το MTSEA. Έξι από τους μεταλλαγμένους υποδοχείς αντέδρασαν με το MTSEA, υποδεικνύοντας έτσι ότι οι πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων αυτών είναι προσανατολισμένες προς την κοιλότητα θέσεων δέσμευσης του CRF1. Το πρότυπο αυτό της διαθεσιμότητας ήταν σύμφωνο με αυτό της δομής άλφα έλικας.
Σε αντίθεση με τις διαμεμβρανικές περιοχές του CRF1 οι οποίες έχει προταθεί ότι δεσμεύουν μικρούς μη πεπτιδικούς ανταγωνιστές, η εξωκυττάρια αμινοτελική περιοχή και οι τρεις εξωκυττάριοι βρόγχοι του υποδοχέα αλληλεπιδρούν με τα πεπτίδια της οικογένειας του CRF, όπως ο CRF και η σοβαγίνη. Σε προηγούμενες μελέτες έχει βρεθεί ότι η δεσμευμένη στον CRF1 σοβαγίνη, βρίσκεται σε κοντινή απόσταση από τη λυσίνη257 του δεύτερου εξωκυττάριου βρόγχου του υποδοχέα (EL2). Για να ελέγξουμε την υπόθεση ότι τα αμινοξέα του EL2 του CRF1 παίζουν σημαντικό ρόλο στη δέσμευση της σοβαγίνης, μεταλλάξαμε αυτά, ένα την κάθε φορά, σε αλανίνη και προσδιορίσαμε τη συγγένεια με την οποία οι μεταλλαγμένοι υποδοχείς δεσμεύαν τη σοβαγίνη. Μόνο οι μεταλλάξεις των Trp259 (W259A) και Phe260 (F260A) σε αλανίνη, καθώς και ο συνδυασμός τους (W259A/F260A), μείωσαν τόσο τη συγγένεια δέσμευσης σοβαγίνης όσο και την ισχύ του πεπτιδίου αυτού να διεγείρει την παραγωγή κυκλικού AMP σε κύτταρα που εκφράζανε τον CRF1. Σε αντίθεση, οι μεταλλάξεις αυτές δε φάνηκε να επηρεάζουν σημαντικά τη στερεοδιαμόρφωση του CRF1, αφού δε μείωσαν τη συγγένεια δέσμευσης της αστρεσίνης και της ανταλαρμίνης, οι οποίες έχει βρεθεί ότι δεσμεύονται σε διαφορετικές περιοχές του CRF1. Οι μεταλλάξεις W259A, F260A και W259A/F260A μείωσαν επίσης και τη συγγένεια δέσμευσης του CRF, υποδηλώνοντας ότι τα αμινοξέα Trp259 και Phe260 πιθανόν παίζουν έναν κοινό σημαντικό ρόλο στη δέσμευση διαφορετικών πεπτιδίων που ανήκουν στην οικογένεια του CRF. Απαλοιφή αμινοξέων από τον CRF και τη σοβαγίνη επηρέασε τις συγγένειες δέσμευσής τους για τον άγριο τύπο CRF1 και τους μεταλλαγμένους υποδοχείς, W259A, F260A και W259A/F260A, με τέτοιο τρόπο που οδήγησε στο συμπέρασμα ότι τα αμινοτελικά αμινοξέα των πεπτιδίων στις θέσεις 8-10 της σοβαγίνης και των αντίστοιχων του CRF, αλληλεπιδρούν με τα Trp259 και Phe260 του EL2 του CRF1. Αυτή είναι η πρώτη φορά που μια συγκεκριμένη περιοχή του CRF1 εμπλέκεται σε λεπτομερείς αλληλεπιδράσεις μεταξύ του υποδοχέα και της αμινοτελικής περιοχής των πεπτιδίων που ανήκουν στην οικογένεια του CRF.
(EL)
The subfamily B of G-protein-coupled receptors (GPCRs) consists of receptors that bind peptides, such as secretin, vasoactive intestinal peptide, glucagon, corticotropin-releasing hormone (CRF), which play a fundamental role in body function. These receptors, like all GPCRs, are plasma membrane proteins sharing a common structural motif of seven membrane-spanning domains (TMs), which have been shown to bind small molecules, such as antalarmin, a non-peptide antagonist of the type 1 receptor for CRF (CRF1). This leads to the hypothesis that similar to family A, rhodopsin-like, GPCRs, the TMs of subfamily B GPCRs form a water-accessible crevice, the binding-site crevice, which extends from the extracellular surface of the receptor into the plane of the membrane. The surface of this crevice is formed not only by residues that can contact small molecules but also by residues that may play a structural role and affect binding indirectly. However, the lack of considerable structural information for the family B GPCRs precludes the support of this hypothesis. To test this hypothesis we started obtaining structural information about subfamily B GPCRs, using as prototype the CRF1 and determining its ability to react with the charged, hydrophilic, lipophobic, sulfhydryl-specific methanethiosulfonate (MTS) derivative, MTSethylammonium (MTSEA). The reaction of MTSEA with CRF1 was tested by its ability to irreversibly inhibit [125I]-sauvagine binding to receptor. Reaction of MTSEA with CRF1 inhibited [125I]-sauvagine binding to CRF1. These results, in conjunction with that the antagonist antalarmin protected against irreversible inhibition by the MTSEA, suggest that MTSEA reacted with the sulfhydryl of one or more cysteines of CRF1. To identify the susceptible cysteine(s), we mutated to serine, one at a time, the four endogenous cysteine residues, Cys128, Cys211, Cys233 and Cys364, which are located in the first (TM1), third (TM3), fourth (TM4) and seventh (TM7) membrane spanning segment of CRF1. In contrast to Cys128 mutation, substitution of Cys211, Cys233 and Cys364 by serine decreased the susceptibility of sauvagine binding to irreversible inhibition by MTSEA. These results suggest that Cys211, Cys233 and Cys364 are exposed in the binding-site crevice of CRF1, and their reaction with MTSEA decreased sauvagine binding to receptor. Subsequently we mutated, one at a time, 18 residues (engineered Cys) of the third membrane spanning segment (TM3) of CRF1 to cysteine, and tested the accessibilities of the engineered Cys for reaction with the MTSEA. Six of the mutant receptors reacted with MTSEA, suggesting that the side chains of these residues are exposed in the binding-site crevice, of CRF1. The pattern of accessibility was consistent with an alpha-helical conformation.
In contrast to membrane spanning segments of CRF1 which have been proposed to bind the small non-peptide antagonists, the extracellular amino-terminal regions and the three extracellular loops of CRF1 interact with the larger peptides belonging to CRF family, such as CRF and sauvagine. In specific previous studies have been shown that upon binding of sauvagine to CRF1, the amino-terminal portion of the peptide lies near Lys257 in the receptor‟s second
XI
extracellular loop (EL2). To test the hypothesis that EL2 residues play a role in the binding of sauvagine to CRF1 we carried out an alanine-scanning mutagenesis study to determine the functional role of EL2 residues (Leu251 to Val266). Only the W259A, F260A, and W259A/F260A mutations reduced the binding affinity and potency of sauvagine. In contrast, these mutations did not seem to significantly alter the overall receptor conformation, in that they left unchanged the affinities of the ligands astressin and antalarmin that have been suggested to bind to different regions of CRF1. The W259A, F260A, and W259A/ F260A mutations also decreased the affinity of the endogenous ligand, CRF, implying that these residues may play a common important role in the binding of different peptides belonging to CRF family. Parallel amino acid deletions of the two peptides produced ligands with various affinities for wild-type CRF1 compared with the W259A, F260A, and W259A/F260A mutants, supporting the interaction between the amino-terminal residues 8 to 10 of sauvagine and the corresponding region in CRF with EL2 of CRF1. This is the first time that a specific region of CRF1 has been implicated in detailed interactions between the receptor and the amino-terminal portion of peptides belonging to the CRF family.
(EN)
