Η ρευματοειδής αρθρίτιδα (ΡΑ) είναι μια χρόνια αυτοάνοση ασθένεια στην οποία εμπλέκονται πολλαπλοί κυτταρικοί τύποι και μονοπάτια. Η πολυπλοκότητα της ασθένειας σε συνδυασμό με την μη επιτυχή θεραπεία και τις υποτροπές των ασθενών επιδεικνύουν την ανάγκη για διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την ασθένεια.
Τα ουδετερόφιλα αποτελούν τον πολυπληθέστερο τύπο λευκών αιμοσφαιρίων και είναι η πρώτη ομάδα κυττάρων που φτάνουν στην άρθρωση. Εκτός από την απελευθέρωση αρκετών φλεγμονωδών κυτταροκινών, τα ουδετερόφιλα απελευθερώνουν επίσης ίνες χρωματίνης που ονομάζονται εξωκυτταρικές παγίδες (ΝΕΤs). Μελέτες σε ασθενείς με ΡΑ έδειξαν αυξημένη αυτόματη απελευθέρωση NETs, γεγονός που υποδηλώνει το σημαντικό τους ρόλο στην παθογένεια της νόσου. Επιπλέον, προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου μας έδειξε ότι τα NETs που προέρχονται από ΡΑ ασθενείς παρουσίασαν αυξημένη δυνατότητα να προκαλέσουν ωρίμανση δενδριτικών κυττάρων (DCs) υγιών ατόμων. Μηχανιστικά, δείξαμε ότι η έκθεση των DCs σε NETs απομονωμένα από CIA προκάλεσε ωρίμανση των DCs η οποία χαρακτηρίστηκε από σημαντική αύξηση των CD80 και CD86 συνδιεγερτικών μορίων καθώς και αυξημένη έκκριση της φλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-6. Ακόμη, τα DCs που ενεργοποιήθηκαν με CIA- NETs προκάλεσαν την ενεργοποίηση αντιγονο-ειδικών Th1 κυττάρων in vitro. Στην παρούσα μελέτη, ο κύριος στόχος μας ήταν να περιγράψουμε τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση των DCs από τα NETs. Για το σκοπό αυτό, εστιάσαμε στα μονοκύτταρα καθώς θεωρούνται προγονικά κύτταρα των DCs που προέρχονται από μονοκύτταρα (moDCs) και παρουσιάζουν παρόμοιες ιδιότητες με τα πρώτα.
Για να επιβεβαιώσουμε την υπόθεση μας, πρώτα, προκαλέσαμε απελευθέρωση των NETs ενεργοποιώντας υγιή ουδετερόφιλα με IgG αντισώματα που απομονώθηκαν από ορούς ενεργών ασθενών με ΡΑ και παρατηρήσαμε αυξημένη απελευθέρωση ΝΕΤs στα ουδετερόφιλα που ενεργοποιήθηκαν με IgG αντισώματα απομονωμένα από ασθενείς σε σχέση με εκείνα που απομονώθηκαν από υγιείς εθελοντές. Στη συνέχεια της μελέτης μας, εστιάσαμε στην επίδραση των NETs στην ενεργοποίηση των μονοκυττάρων. Όταν μετρήσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης των κυτταροκινών σε μονοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν με NETs και παρατηρήσαμε αυξημένη έκφραση της προφλεγμονώδους κυτταροκίνης (TNF-α), ενδεικτική της ενεργοποίησης των μονοκυττάρων.
Σύμφωνα με πρόσφατες δημοσιεύσεις, η επαγωγή της αυτοφαγίας φαίνεται να συνδέεται με την ενεργοποίηση των μονοκυττάρων. Γι’ αυτόν τον λόγο, εστιάσαμε στο μηχανισμό αυτοφαγίας των μονοκυττάρων. Τα μονοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν με NETs, παρουσίασαν μειωμένη έκφραση του αυτοφαγικού δείκτη LC3 και αυξημένη έκφραση της p62 στη συνεστιακή μικροσκοπία. Επίσης, σύμφωνα με τη μέθοδο Western Blotting, τα επίπεδα της p62 έδειξαν ήπια αύξηση. Τα παραπάνω δεδομένα υποδηλώνουν μειωμένη αυτοφαγία.
8
Στη συνέχεια, προσπαθήσαμε να προσδιορίσουμε τα ενδοκυττάρια σήματα που ευθύνονται για την μείωση της αυτοφαγίας σε μονοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν με NETs. Για να απαντήσουμε σε αυτό το ερώτημα, χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής για τους φωσφορυλιωμένους δείκτες του mTOR μονοπατιού, pmTOR και pAkt και τα κάτωθι μόρια του mTORC1 μονοπατιού pS6 και p4EBP1 σε μονοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν με NETs και παρατηρήσαμε αυξημένη έκφραση του PI3K / Akt / mTOR άξονα.
(EL)
Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic autoimmune disease that involves multiple immune cell types and biological processes. Complexity of RA in combination with inadequate treatment responses and frequent patient relapses, underscore the necessity to delineate the molecular mechanisms underlying the disease. Neutrophils are the most abundant white blood cell type and the first cells that reach the inflamed synovium. Besides releasing several inflammatory cytokines, neutrophils also externalize chromatin fibers called extracellular traps. RA patients present increased spontaneous formation of NETs, which indicates an important role in pathogenesis of the disease. Moreover, our previous work revealed that RA-derived NETs show an increased potential to induce the maturation of dendritic cells (DCs) from healthy individuals. Mechanistically, we showed that exposure of DCs to Collagen induced Arthritis (CIA)-derived NETs induced DC maturation characterized by significant up-regulation of CD80 and CD86 costimulatory molecules as well as elevated secretion of the inflammatory cytokine IL-6. In agreement, CIA-NET-treated DCs promoted the induction of antigen-specific Th1 cells in vitro. In the present study, our main purpose was to delineate the mechanisms implicated in NET-induced activation of DCs. For this purpose, we focused on monocytes as they represent the progenitor cells of monocyte derived dendritic cells (moDCs) and exhibit similar properties with DCs. To address our hypothesis, first, we provoked NET formation with IgG antibodies isolated from sera of active RA patients and observed increased NET release on healthy neutrophils as compared with neutrophils treated with IgG isolated from healthy volunteers. Next, we focused on the effect of RA IgG-induced NETs on the activation of monocytes. We measured the secreted protein levels of cytokines in monocytes treated with NETs and observed increased expression of Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) indicative of monocytes activation. According to recent evidence, induction of autophagy is highly linked with the activation of monocytes. For that reason, we focused on the autophagic machinery of monocytes. Interestingly, monocytes treated with RA IgG-induced NETs showed decreased expression of the autophagic marker LC3 and increased expression of p62 in confocal microscopy. In Western blotting, p62 levels also tend to increase. The above evidence suggests impaired autophagy in monocytes treated with RA IgG NETs. Next, we sought to determine the intracellular signaling events mediating the NET-dependent downregulation of monocyte autophagic machinery. To address this, we performed flow cytometry on monocytes treated with NETs for the phosphorylated intracellular markers of the mTOR pathway, pmTOR and pAkt and the downstream molecules of the mTORC1 pathway, pS6 and p4EBP1 and observed increased expression of the PI3K/Akt/mTOR axis.
6
To extend our findings in vivo, we used the collagen induced arthritis mouse model (CIA). CIA bone marrow neutrophils (PMNs) present increased spontaneous NET formation as compared with control BM PMNs. Treatment of bone marrow derived dendritic cells (BMDCs) with CIA NETs revealed increased antigen presenting capacity as compared with the control. Collectively, our findings indicate that RA IgG induced NETs may promote monocyte activation through decreased autophagy and increased PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.
(EN)
