Η μεταβολομική, μια από τις πιο πρόσφατες ομικές πλατφόρμες, είναι μια υψηλής απόδοσης ανάλυση της φυσιολογίας ενός βιολογικού συστήματος σε μεταβολικό επίπεδο και αφορά στον ταυτόχρονο προσδιορισμό και ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης μεγάλου αριθμού μεταβολιτών μικρού μοριακού βάρους υπό συγκεκριμένες συνθήκες κυτταρικής λειτουργίας το σύνολο των οποίων αντιπροσωπεύουν το μεταβόλωμα. Οι μεταβολίτες είναι μόρια χαμηλού μοριακού βάρους που αποτελούν τα αντιδρώντα και προϊόντα των χημικών αντιδράσεων που λαμβάνουν χώρα σε ένα βιολογικό σύστημα, επίσης αποτελούν τα δομικά στοιχεία άλλων βιολογικών μορίων όπως π.χ. των πρωτεϊνών. Το προφίλ των συγκεντρώσεων όλων των (μετρήσιμων) μεταβολιτών αποτελεί το μεταβολικό αποτύπωμα/προφίλ ενός βιολογικού συστήματος για μια δεδομένη στιγμή και κατάσταση. Η οποιαδήποτε αλλαγή των συγκεντρώσεων των μεταβολιτών αντικατοπτρίζει την απόκριση ενός βιολογικού συστήματος τόσο σε περιβαλλοντικές όσο και σε γενετικές αλλαγές, και μας δίνει τη δυνατότητα κατανόησης των φαινοτύπων. Για τον λόγο αυτό είναι αναγκαία η μη στοχευόμενη μεταβολομική ανάλυση που αναφέρεται στην ποσοτικοποίηση όσο το δυνατόν περισσότερων μεταβολιτών ενός βιολογικού συστήματος καθώς και η απόκτηση γνώσης για τις μοριακές δυναμικές και τις ταχύτητες αυτών των αντιδράσεων στο ανακατασκευασμένο εν δυνάμει μεταβολικό δίκτυο. Παρόλ΄αυτά η ανάλυση των μεταβολιτών δεν είναι τόσο ευθύς διαδικασία λόγω της μεγάλης ποικιλότητας που παρουσιάζουν ως προς την χημική δομή. Για την ταυτοποίηση και μέτρηση της συγκέντρωσης των μεταβολιτών οι κύριες αναλυτικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται είναι η χρωματογραφία υγρών ή αερίων σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας (liquid chromatography – mass spectrometry, LC-MS / Gas chromatography – mass spectrometry, GC-MS) και ο πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός (ΝΜR). Στον χρωματογράφο υγρών-φασματόμετρο μάζας χρησιμοποιείται ο ιοντισμός από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό (Electron Spray Ionization-ESI) για τον ιονισμό των μεταβολιτών που αναλύονται. Αυτό έχεις ως αποτέλεσμα να προκύπτουν συνήθως μοριακά ιόντα για κάθε ουσία δυσκολεύοντας έτσι την ταυτοποίησή της.
Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής έγινε προσπάθεια να χρησιμοποιηθεί η τεχνολογία της διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (Tandem Mass or MS/MS), που
επιτρέπει την θραυσματοποίηση των μοριακών ιόντων, με σκοπό το φάσμα θραυσμάτων που προκύπτει να διευκολύνει την ταυτοποίηση άγνωστων μεταβολιτών.
Αρχικά χρησιμοποιήθηκε η χρωματογραφία υγρών σε συνδυασμό με διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS) για να αναλυθούν πρότυπες ουσίες και να ληφθούν φάσματα μάζας που σε συνδυασμό με το χρόνο έκλουσης χαρακτηρίζουν κάθε ουσία. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν βιολογικά δείγματα ώστε να επαληθευτούν τα φάσματα θραυσμάτων των πρότυπων ουσιών σε πραγματικές συνθήκες ανάκτησης μεταβολικών προφίλ. Τέλος ανακτήθηκαν φάσματα θραυσμάτων από μέχρι τότε άγνωστους μεταβολίτες που έχουν βρεθεί σε βιολογικά δείγματα. Τα φάσματα αυτά καθώς και άλλα χαρακτηριστικά των άγνωστων μεταβολιτών χρησιμοποιήθηκαν ώστε να γίνει αναζήτηση σε βάσεις δεδομένων για ουσίες με αντίστοιχα χαρακτηριστικά, με σκοπό τον προσδιορισμό των άγνωστων μεταβολιτών. Επίσης, για την αναγνώριση των άγνωστων ουσιών εκμεταλλευτήκαμε προϋπάρχουσα γνώση για την συμπεριφορά των συγκεντρώσεων τους σε συνθήκες καταπόνησης που μας επιτρέπει να προβλέψουμε την θέση τους στο μεταβολικό δίκτυο του οργανισμού από όπου προέκυψαν.
(EL)
Metabolomics, one of the newest omic (holistic) platforms, is a high performance analysis of the physiology of a biological system in a metabolic level and it regards with the simultaneous determination and quantification of the concentration of large numbers of low molecular mass metabolites under certain circumstances of cell functions, which in total represent the metabolome. Metabolites are low molecular mass molecules which constitute the reactants and the products of the chemical reactions that take place in a biological system, as well the structural elements of other biomolecules, such as proteins. The values of the concentration of each metabolite constitute the metabolic profile of the biological system at a certain time point and condition. Every alteration of these values reflects the interaction of the biological system with environmental and genetic changes and it offers us the ability to understand these phenotypes. For that said, it is necessary to perform an untargeted metabolomic analysis, in order to quantify as many as possible metabolites, and to gain knowledge about the molecular forces and the pace of these reactions in the potential reconstructed metabolic network. However, this analysis is not an easy procedure due to the large chemical structure variety of metabolites. The main analytic methods being used for the identification and the quantification of each metabolite are liquid or gas chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS or GC-MS) and nuclear magnetic resonance (NMR). In liquid chromatography coupled with mass spectrometry the most common method to ionize the molecules that are going to be analyzed is Electron Spray Ionization (ESI), which leads to molecular ions for each substance, making it harder to identify it.
In the present Master’s Thesis was made an effort to use the technology of tandem mass spectrometry (MS/MS), which allows the fragmentation of the molecular ions, in order to collect data from the fragmentation spectrum for the identification of unknown metabolites. Firstly, prototype substances were analyzed with LC-MS/MS in order to get the mass spectrum and retention time, which are unique for each substance. Additionally, biological samples were analyzed in order to validate the fragments spectra of prototype substances in actual conditions of metabolic profile recovery. Finally, mass spectra of fragments of previously unknown metabolites were also recovered. These spectra alongside other characteristics of unknown metabolites were used in order to search for matching substances in specific
databases and proceed with their identification. Moreover, for the identification of unknown substances we used preexisted knowledge about their concentration in stressing conditions, which allows us to predict their place in the metabolic network of the organism from which they arose.
(EL)
Πανεπιστήμιο Πατρών
