Οι λυτικές μονοοξυγενάσες των πολυσακχαριτών (Lytic Polysaccharide Monooxygenases,
LPMOs) αποτελούν μια νεα κατηγορία ενζύμων που έχει ανακαλυφθεί μόλις την προηγούμενη
δεκαετία. Ο ρόλος τους θεωρείται πολύ σημαντικός στην αποδόμηση της λιγνινοκυτταρινούχου
βιομάζας μέσω ενός μοναδικού οξειδοαναγωγικού μηχανισμού, με την ερευνητική κοινότητα να
στρέφει ολοένα και περισσότερο την προσοχή της στις LPMOs. Αποτέλεσμα της δράσης τους
είναι η διάσπαση α-1,4’ ή β-1,4’ γλυκοζιτικών δεσμών και ο σχηματισμός προϊόντων με C1- ή C4-
οξειδωμένα άκρα. Οι LPMOs μπορούν να αξιοποιηθούν σε αρκετές βιοτεχνολογικές εφαρμογές
όπως η αύξηση της απόδοσης της αποδόμησης της βιομάζας από την συνεργιτική τους δράση με
άλλα υδρολυτικά ένζυμα σε βιομηχανικές συνθήκες που απαιτούν σταθερότητα σε υψηλές
θερμοκρασίες αλλά και η παραγωγή νέων καινοτόμων υλικών όπως η νανοκυτταρίνη. Σκοπός
της παρούσας διπλωματικής εργασίας αποτέλεσε η ετερόλογη έκφραση, η απομόνωση και ο
βιοχημικός χαρακτηρισμός μιας μη χαρακτηρισμένης LPMO της οικογένειας ΑΑ9 από το
γονιδίωμα του θερμόφιλου μύκητα M. Thermophila. Ο μύκητας περιέχει μια μεγάλη ποικιλία
γονιδίων που κωδικοποιούν υδρολυτικά ένζυμα, αναπτύσσεται βέλτιστα σε θερμοκρασίες 45-50
oC και κατά την ανάπτυξη του σε υποστρώματα λιγνινοκυτταρίνης εκκρίνει εξωκυτταρικά σε
μεγάλα επίπεδα ΑΑ9 LPMOs. Η αλληλουχία MYCTH_110651, που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη που
μελετάται σε αυτή την εργασία, ανασύρθηκε βιοπληροφορικά από σχετικές βάσεις δεδομένων
και περιέχει την λειτουργική περιοχή πρόσδεσης υδατανθράκων CBM1 (Carbohydrate-Binding
Module Family 1). Μετά από την βιοπληροφορική ανάλυση της αλληλουχίας, ακολούθησε η
ετερόλογη έκφραση του γονιδίου με τη χρήση ανασυνδυασμένων πλασμιδιακών φορέων
pGAPZaC στη ζύμη P. pastoris και την αξιοποίηση του υποκινητή GAP σε θρεπτικό μέσο με
γλυκόζη ως πηγή άνθρακα. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη παράχθηκε σε μεγάλη ποσότητα και
απομονώθηκε αποτελεσματικά σε στήλη χρωματογραφίας συγγένειας ακινητοποιημένου
μετάλλου (IMAC). Το μοριακό βάρος της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης προσδιορίστηκε ίσο με
55 kDa με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE, έναντι του θεωρητικού μοριακού βάρους 34 kDa. Το
παραπάνω σε συνδυασμό με τον μεγάλο αριθμό πιθανών θέσεων Ο-γλυκοζυλίωσης συνηγορούν
στο συμπέρασμα ότι η P. pastoris υπεργλυκοζυλιώνει την πρωτεΐνη. Ο προσδιορισμός του
ισοηλεκτρικού σημείου με ηλεκτροφόρηση IEF-PAGE έδωσε τρεις πρωτεϊνικές ζώνες σε ένα
εύρος τιμών pI 5.4-6.4, κάτι το οποίο αποδίδεται στις ισομορφές ττης πρωτεΐνης που
δημιουργούνται από τα διαφορετικά πρότυπα γλυκοζυλίωσης της P. pastoris κατά την μετα-
μεταφραστική τροποποίηση. Από την ανάλυση προϊόντων της ενζυμικής δράσης σε δέκα
πολυσακχαρίτες με χρωματογραφία εναλλαγής ιόντων HPAE-PAD, η πρωτεΐνη εμφανίζει
χαρακτηριστική ενεργότητα στο υπόστρωμα κυτταρίνης διογκωμένης με φωσφορικό οξύ PASC
επιβεβαιώνοντας τη βιβλιογραφία όσον αφορά την συσχέτιση της περιοχής CBM1 των ΑΑ9 με
την ενεργότητα σε κρυσταλλικά υποστρώματα κυτταρίνης. Συμπληρωματικά, η LPMO φαίνεται
να έχει μόνο C1-οξειδωτική δράση στην κυτταρίνη καθιστώντας τη κατάλληλη για εφαρμογές
απομόνωσης νανοκυτταρίνης. Η ειδική ενεργότητα της πρωτεΐνης υπολογίστηκε ίση με 3.19 U/g
σε συνθήκες pH = 6, 40 oC στο υπόστρωμα 2,6-DMP παρουσία H2O2. Οι τιμές των μεγεθών που
προσδιορίστηκαν βρίσκονται σε όμοια επίπεδα με αυτά άλλων χαρακτηρισμένων ΑΑ9 LPMOs
μυκητιακής προέλευσης της βιβλιογραφίας.
(EL)
Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) are a novel class of enzymes discovered recently
in the previous decade. Their role is considered very important in the degradation of
lignocellulose biomass through a unique redox mechanism of high scientific and industrial
interest. The result of their action is the cleavage of α-1,4 'or β-1,4' glycosidic bonds and the
formation of C1- or C4- oxidized products. LPMOs can be utilized in several biotechnological
applications such as increasing the efficiency of biomass degradation due to their synergistic
action with other hydrolytic enzymes in industrial conditions that require stability at high
temperatures and the production of new innovative materials like nanocellulose. The objective
of this thesis was the heterologous expression, purification and biochemical characterization of
an uncharacterized LPMO of the AA9 family from the genome of the thermophilic fungus M.
Thermophila. This fungus contains a wide variety of genes encoding hydrolytic enzymes, it marks
optimal growth at temperatures of 45-50 oC and several genes encoding AA9 proteins are highly
upregulated on lignocellulosic substrates. The MYCTH_110651 sequence, which encodes the
protein, was bioinformatically retrieved and contains the functional domain CBM1
(Carbohydrate-Binding Module Family 1). Bioinformatics analysis of the sequence was followed
by heterologous expression of the gene using recombinant pGAPZaC plasmid vectors in P. pastoris
host by utilizing the GAP promoter with glucose as a main carbon source. The recombinant protein
was produced in large quantities and effectively purified on an immobilized metal affinity
chromatography column (IMAC). The molecular weight of the recombinant protein was
determined 55 kDa by SDS-PAGE electrophoresis and the theoretical molecular weight was
calculated 34 kDa. The above-mentioned in combination with the large number of possible Oglycosylation
sites proves that P. pastoris hyperglycosylates the protein. The isoelectric point
determination was held by IEF-PAGE electrophoresis and showed three protein bands in the range
of 5.4-6.4 pI values. This is attributed to the protein isoforms generated by the different
glycosylation patterns of P. pastoris during post-translational modification. From the analysis of
products of enzymatic activity on ten polysaccharides by the HPAE-PAD chromatography method,
the protein shows high levels of activity on the PASC (Phosphoric acid swollen cellulose) confirming
the literature in regard to the association of the CBM1 region of AA9 with activity on crystalline
cellulose substrates. Additionally, this LPMO appears to produce only C1-oxidized products on
cellulose making it suitable for nanocellulose production applications. The specific activity of the
protein was calculated 3.19 U/ g at pH = 6, 40 oC conditions on 2,6-DMP substrate in the presence
of H2O2. The values of the above-determined properties are at similar levels to other
biochemically characterized AA9 LPMOs of fungal origin in the literature.
(EN)
National Technical University of Athens
