Ανακάλυψη και βιοχημικός χαρακτηρισμός μιας καινοτόμας πολυεστεράσης για την ενζυμική αποικοδόμηση πλαστικών

Ανακάλυψη και βιοχημικός χαρακτηρισμός μιας καινοτόμας πολυεστεράσης για την ενζυμική αποικοδόμηση πλαστικών (EL)

Δημοπούλου, Φαίδρα (EL)

Dimopoulou, Faidra (EN)

Τόπακας, Ευάγγελος

ntua (EL)

Μαμμά, Διομή (EL)

Τόπακας, Ευάγγελος (EL)

Παππά, Αθηνά (EL)

bachelorThesis

2021-02-26

2021-09-06T09:32:30Z

Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η ανακάλυψη και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός μιας νέας πολυεστεράσης για την ενζυμική αποικοδόμηση του τερεφθαλικού πολυαιθυλενίου (PET) και άλλων πολυεστέρων. Μέχρι σήμερα, η λίστα των ενζύμων που υποβαθμίζουν το PET είναι πολύ μικρή. Η ανακάλυψη μιας πιθανής πολυεστεράσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ως εργαλείο τον αλγόριθμο BLAST και ως βάση δεδομένων τη UniProt. Αναζητήθηκε αλληλουχία ομόλογη με εκείνες των γνωστών PET-υδρολασών. Η αλληλουχία που εντοπίστηκε προέρχεται από ένα στέλεχος του γένους Moraxella και ονομάστηκε MorEst. Η πρωτεΐνη εμφανίζει την υψηλότερη ομολογία με το ένζυμο PETase του Ideonella sakaiensis (45%) και με την κουτινάση LCC (43,6%). Στη συνέχεια εντοπίστηκε η σηματοδοτική αλληλουχία έκκρισης η οποία είναι υπεύθυνη στο φυσικό στέλεχος για τη μεταφορά της πρωτεΐνης στον εξωκυτταρικό χώρο. Το συνθετικό γονίδιο, απουσία της σηματοδοτικής αλληλουχίας έκκρισης, εισήχθη σε πλασμιδιακό φορέα pET-22b(+), εκφράστηκε ετερόλογα σε επιδεκτικά βακτηριακά στελέχη Escherichia coli BL21 (DE3) και στη συνέχεια απομονώθηκε. Ακολούθησε ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Η MorEst εμφάνισε μοριακό βάρος στα ≈33 kDa και είχε βέλτιστη δράση για θερμοκρασία 30 °C και τιμή pH ίση με 9. Το ένζυμο εμφάνισε εξαιρετική σταθερότητα για ένα εύρος pH 5-10, ενώ φάνηκε ότι είναι πιο σταθερό σε μεγαλύτερη συγκέντρωση αλάτων (200 mM) σε σύγκριση με χαμηλή συγκέντρωση (20 mM). Αντίθετα, το ένζυμο δεν εμφανίζει την ίδια σταθερότητα όσον αφορά τη θερμοκρασία. Στη βέλτιστη θερμοκρασία των 30 °C η MorEst διατηρεί περισσότερο από το 70% της ενεργότητάς της για 8 h, ενώ στις θερμοκρασίες 40 και 50 °C χάνει το 50% και 90% της αρχικής ενεργότητας αντίστοιχα, στις 2 h. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν κινητικές μελέτες για τέσσερις εστέρες της πάρα-νιτροφαινόλης (pNP) με λιπαρά οξέα διαφορετικών μηκών ανθρακικής αλυσίδας και συγκεκριμένα τα pNP-C2, -C4, -C8 και -C10. Η MorEst εμφάνισε μεγαλύτερη συγγένεια και αποτελεσματικότητα για το pNP-C4, με σταθερά KM ίση με 1,7 mM και λόγο kcat/KM ίσο με 17,6 mM-1·s-1 αντίστοιχα. Τέλος, μελετήθηκε η ικανότητα υποβάθμισης πολυεστέρων υψηλής κρυσταλλικότητας (Xc) με αντιδράσεις μέτρησης απώλειας βάρους σε ρυθμιστικό διάλυμα 0,1 M Na-Phosphate pH 7, για 3 ημέρες και σε θερμοκρασία 30 °C. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη αποικοδόμησε τα πολυμερή PCL (Xc=45%) και PHB (Xc=49%) κατά 26,5 και 13,4% αντίστοιχα, ενώ για τις συγκεκριμένες συνθήκες δεν παρουσίασε υδρολυτική ικανότητα έναντι των PET (Xc=35%), PBS (Xc=64%) και PLA (Xc=11%). (EL)

Πλαστική ρύπανση (EL)

Μικροπλαστικά (EL)

Τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο (EL)

Ενζυμική αποικοδόμηση (EL)

Πολυεστεράση (EL)

Biodegradation (EN)

Poly(ethylene terephthalate) (PET) (EN)

Enzymatic hydrolysis (EN)

Microplastics (EN)

Plastic pollution (EN)

Greek

Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV) (EL)

Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/

National Technical University of Athens

Digital Library of National Technical University of Athens | Dspace@NTUA

Κεντρική Βιβλιοθήκη Ε.Μ.Π.

Ιδρυματικό Αποθετήριο

Διπλωματικές Εργασίες